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| + | '''Purpose''' | ||
| + | :(1) 10月3日の実験(3)の結果の確認 [福山] | ||
| + | :(2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理 [福山] | ||
| + | :(3) SufA,ahpC,の制限酵素処理 [福山] | ||
| + | :(4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック [福山] | ||
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| + | '''Method''' | ||
| + | :(1) 10月3日の実験(3)の結果の確認 | ||
| + | :: クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した | ||
| + | |||
| + | :(2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理 | ||
| + | :: 25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した | ||
| + | :: ↓上清を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした | ||
| + | :: ↓SolutionⅡを250μl加えた | ||
| + | :: ↓SolutionⅢを350μl加えた | ||
| + | :: ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清をカラムに入れた | ||
| + | :: ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた | ||
| + | :: ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた | ||
| + | :: ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
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| + | :: ↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった | ||
| + | :: ↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1) | ||
| + | :: また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2) | ||
| + | :: ↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた | ||
| + | :: ↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清を回収した | ||
| + | :: ↓70 %エタノールを800 μl加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清を除いた | ||
| + | :: ↓乾燥した | ||
| + | :: ↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3) | ||
| + | :: ↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした | ||
| + | :: ↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った | ||
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| + | :: 表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った | ||
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| + | :(4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック | ||
| + | :: ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した | ||
| + | :: そして、制限酵素処理した2つの試料と | ||
| + | :: 制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した | ||
| + | :: ↓135V ,20分で電気泳動 | ||
| + | :: ↓EtBr で20分間染色 | ||
| + | :: バンドを確認した | ||
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| + | ::<TD COLSPAN="2">pSB1C3(total 25 μl)</TD></TR> | ||
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| + | |||
| + | '''Results''' | ||
| + | :(1) DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。 | ||
| + | ::あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった | ||
| + | :(2) (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl | ||
| + | ::(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。 | ||
| + | ::(*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl ← 6.8倍濃縮 | ||
| + | :(3) 明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、 | ||
| + | ::フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う | ||
| + | :(4) ''Eco''RⅠ, ''Spe''Ⅰで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した | ||
| + | ::他の2試料は予想通りであった | ||
| + | |||
| + | '''Consideration''' | ||
| + | :(4) クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる | ||
| + | ::次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである | ||
== October 5 == | == October 5 == | ||
Revision as of 09:52, 24 October 2010
Contents |
October 3
Time
- 11:00~18:30
Member
- 岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
- Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura
Purpose
- (1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション [福山、革島]
- (2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き) [岩城]
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養 [吉村]
- (4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR [革島、吉村]
Method
- (1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
- ＊ライゲーション
- pSB1C3 + SufA
- + SufA+GFP
- + AhpC+GFP をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
- ↓16℃30min
- ＊トランスフォーメーション
- コンピテントセル100μLずつ加えた
- ↓氷上30min
- ↓42℃45min
- ↓氷上2min
- ↓SOC培地900μL加えた
- ↓1h振とう培養
- ↓ストリーク
- (2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
- 10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
- 0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
- ↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
- ↓氷冷 15min.
- ↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
- ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
- ↓上清を捨てた
- ↓70 % EtOHを50 µlを加えた
- ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
- ↓Remove sup.
- ↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
- ↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
- ↓95 ℃,2 min加熱した
- ↓氷冷(急冷)
- ↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
- ↓シークエンス用のゴムのふたをした
- ↓シークエンサーにいれた
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
- ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
- (4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
- 以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
＊ahpC,sufA,oxyR,sodA プライマー(PM) 0.75ul テンプレートDNA 0.5ul MgSO4 2ul dNTPs 2.5ul KODplus 0.5ul Buffer 2.5ul Milli Q 16.25ul Total 25ul 表2: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 61℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min ∞ 35サイクル
- ＊PCR産物の確認
- 各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
- ↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
- ↓135v,20minで電気泳動
- ↓20minEtBr染色
- ↓UV照射下でバンドの確認
Results
- (1) 翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
- (2) 明日、シークエンスを確認
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
- (4) 吸光度を測定し濃度を計算した結果、
- ahpC…1482ng/μl
- 2…360ng/μl
- sufA1…265ng/μl
- 2…425ng/μl
- oxyR1…367ng/μl
- 2…369ng/μl
- sodA1…427ng/μl
- 2…340ng/μl
- yaiA1…267ng/μl
- 2…481ng/μl
- acrAB1…368ng/μl
- 2…557ng/μl
- dps1…530ng/μl
- 2…440ng/μl
- だった(全量は全て19μl)
- ＊電気泳動
- 全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた
October 4
Time
- 19：00~22:30
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- (1) 10月3日の実験(3)の結果の確認 [福山]
- (2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理 [福山]
- (3) SufA,ahpC,の制限酵素処理 [福山]
- (4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック [福山]
Method
- (1) 10月3日の実験(3)の結果の確認
- クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した
- (2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理
- 25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった
- ↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)
- また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)
- ↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた
- ↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した
- ↓上清を回収した
- ↓70 %エタノールを800 μl加えた
- ↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
- ↓上清を除いた
- ↓乾燥した
- ↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)
- ↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした
- ↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った
表1: 制限酵素処理1 単位はμl 試料1 試料2 試料3 試料4 DNA溶液 12.5 13 13 13 Buffer H 1.5 1.5 1.5 EcoRⅠ 0.5 0.5 PstⅠ 0.5 0.5 全量 15 15 15 13 表2: 制限酵素処理2 試料(μl) DNA溶液 29 Buffer H 4 EcoRⅠ 1 PstⅠ 1 Milli Q 5 全量 40
- (3) SufA,ahpC,の制限酵素処理
- 表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った
表3: sufA(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 0.5 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 2.5μl H2O 1.5 μl 表4: ahpC(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 0.5 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 2.5 μl H2O 1.5 μl
- (4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック
- ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した
- そして、制限酵素処理した2つの試料と
- 制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した
- ↓135V ,20分で電気泳動
- ↓EtBr で20分間染色
- バンドを確認した
pSB1C3(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 1 μl SpeⅠ 1 μl M buffer 2.5 μl H2O 0.5μl pSB1C3(total 25 μl) DNAsol 20 μl SpeⅠ 1 μl M buffer 2.5 μl H2O 1.5μl
Results
- (1) DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。
- あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった
- (2) (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl
- (*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。
- (*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl ← 6.8倍濃縮
- (3) 明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、
- フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う
- (4) EcoRⅠ, SpeⅠで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した
- 他の2試料は予想通りであった
Consideration
- (4) クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる
- 次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである
October 5
October 6
Time
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- (1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ [福山]
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]
Method
- (1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
- 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
- ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
- ↓遠心１分（25℃、14,500 rpm）して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
- ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分（25℃、14,500 rpm）
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
- ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分（4℃、15,000 rpm）(*1)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分（4℃、15,000 rpm）
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
- Premix 2 μl
- 5xsequence buffer 1 μl
- Primer(1 μM) 1.6 μl
- プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
- 総量 10 μl
表1: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 96℃ 96℃ 50℃ 60℃ 4℃ 1min 10sec 5sec 4min ∞ 30サイクル
- エタノール沈殿
- ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
- ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
- ↓氷上で15分間冷やした
- ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓乾燥させた(よく乾かした)
- ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
- ↓95 ℃で2分加熱した
- ↓氷上で冷やした(急冷)
- ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
- ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
- ↓シークエンス用の蓋をした
- ↓シークエンサーに入れた
Results
- (1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
- DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
- その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
- (2) 十分に正確な塩基配列を読むことができなかった
Consideration
- (1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
- (今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
- DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
- (2) コンタミの可能性が考えられる
October 7
Time
- 18:00~
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- (1) DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ [福山]
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]
Method 【実験方法】
- (1) DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
- 前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
- 遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
- ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
- ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした
- このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
- H2O 全量10 μlになるように調整した
- Premix 2 μl
- 5xsequence buffer 1 μl
- Primer(1 μM) 1.6 μl
- プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
- 総量 10 μl
表1: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 96℃ 96℃ 50℃ 60℃ 4℃ 1min 10sec 5sec 4min ∞ 30サイクル
- エタノール沈殿
- ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
- ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
- ↓氷上で15分間冷やした
- ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓乾燥させた(よく乾かした)
- ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
- ↓95 ℃で2分加熱した
- ↓氷上で冷やした(急冷)
- ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
- ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
- ↓シークエンス用の蓋をした
- ↓シークエンサーに入れた
Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す
表2: 吸光度測定結果 ahpC-1 ahpC-2 sufA-1 sufA-2 0.066 0.118 1.005 0.022 0.053 0.114 0.681 0.023 0.055 0.111 0.492 0.024 0.048 0.106 0.448 0.016 0.047 0.103 0.328 0.015 0.276 平均 0.0538 0.1104 0.5383 0.02 希釈前の濃度
(ng/μl)269 552 2692 100
- (2) 後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった
Consideration
- (2) RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
- 次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき
