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Revision as of 08:16, 22 October 2010

September 19

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Time

10：00～

Member

古道、竹内、臼井

Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]

(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動

→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3

のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]

(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]

Method

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定

＜材料＞

　　培養済みyaiA on pSB6A1

　　　　　　SufA on pSB6A1

　　　　　　ahpC on pSB6A1

　　　　　　プロモーターレスpSB6A1

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)

　　1xPBS

＜方法＞

　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を

　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した

　↓吸光度測定した

　↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた

　↓37℃、30min、振とう培養した

　↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた

　↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした

　↓蛍光数値の測定をした

(2)　電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション

　11日(14)(15)(16)と手順は同じである

　変更点のみ以下に示す

　ゲル抽出後の濃度より

　　　　X=ベクター(pSB1C3)の量

　　　　Y=プロモーターの量　　　とし、

　ベクターの濃度(94ng/μL)xX　：　プロモーターの濃度xY　＝　1：2

　ベクターの長さ(2072)　　　　　　　プロモーターの長さ

　よりライゲーションの濃度を決定した

表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H₂O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H₂O 2.3μL

　これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク

　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の

　コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養

　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、

　クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした

(5)　AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養

　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

　プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた

　↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)

表2: 吸光度測定結果
1/20	yaiA	SufA	ahpC	プロモーターレスpSB6A1
	0.392	0.420	0.460	0.430
	0.394	0.430	0.460	0.454
0.460	0.430	0.458	0.452

表3: 蛍光数値測定結果

yaiA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.1638	0.1632	0.1647
100μM	0.1459	0.1406	0.1422
10μM	0.1611	0.1652	0.1605
1μM	0.1727	0.1781	0.1789
100nM	0.1578	0.1635	0.1579
10nM	0.1739	0.1795	0.1751
1nM	0.1594	0.1625	0.1598
H₂O₂less	0.1695	0.1695	0.1675

SufA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	2.261	2.318	2.337
100μM	1.552	1.58	1.568
10μM	1.345	1.37	1.37
1μM	1.337	1.343	1.338
100nM	1.384	1.404	1.409
10nM	1.276	1.201	1.284
1nM	1.306	1.288	1.276
H₂O₂less	1.268	1.265	1.272

ahpC
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	12.27	12.64	13.2
100μM	7.322	7.432	7.579
10μM	5.981	6.036	6.112
1μM	4.851	4.899	4.974
100nM	4.181	4.184	4.256
10nM	4.559	4.633	4.689
1nM	4.436	4.381	4.466
H₂O₂less	4.788	4.826	4.931

プロモーターレスpSB6A1
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.3694	0.3775	0.3734
100μM	0.4109	0.407	0.3898
10μM	0.2903	0.2949	0.2925
1μM	0.2692	0.2748	0.2714
100nM	0.3457	0.3414	0.3443
10nM	0.2785	0.2854	0.2838
1nM	0.3217	0.333	0.3311
H₂O₂less	0.2171	0.2207	0.2268

(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった

これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため

ゲル抽出後の吸光度

AcrAB
1回目	0.024
2回目	0.017
3回目	0.005
4回目	0.017
5回目	0.005
Ave	0.0136
濃度	13.6ng/μL

dps
1回目	0.018
2回目	0.016
3回目	0.017
4回目	0.017
5回目	0.017
Ave	0.015
濃度	16.6ng/μL

oxyR
1回目	0.019
2回目	0.018
3回目	0.019
4回目	0.019
5回目	0.019
Ave	0.0188
濃度	18.8ng/μL

ahpC
1回目	0.036
2回目	0.035
3回目	0.035
4回目	0.035
5回目	0.036
Ave	0.035
濃度	35.0ng/μL

sufA
1回目	0.014
2回目	0.018
3回目	0.018
4回目	0.018
5回目	0.017
Ave	0.017
濃度	17.0ng/μL

(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた

37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを

ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる

(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した

次回この培養させた

AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する

(5)　次回、集菌作業を行う

September 20

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Time

10：00～

Member

竹内、革島、中村

Takeuchi,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理　[革島]

(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定　[中村]

Method

(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理

＊培養

　白金耳によるLB培地3mL(＋クロラムフェニコール)へのpSB1C3の培養

＊ミニプレ

　9/15カラム不使用のミニプレ参照

　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした

＊制限酵素処理

　EcoRⅠ、pstⅠを3μL用い、Total　50μLで処理した

(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定

　Overnightで培養したahpC及びsufA各2本のO.D.₆₀₀を測定した

　↓適正であったahpC1本とsufA2本をLB培地(+amp)でO.D.₆₀₀が0.5になるように希釈した

　↓O.D.₆₀₀が0.4～0.6の間にあることを確認し、500μLずつエッペンに分注した(各5本)

　↓終濃度が100nM、50nM、10nM、5nM、1nMとなるように過酸化水素を加えた

　↓37℃、30minインキュベート

　↓cfg.　4℃　10,000rpm　1min

　↓アスピレーターで上清を除いた

　↓ペレットをPBS150μLに溶かし、内100μLを蛍光強度測定に用いた

　　　　＊過酸化水素付加後の時間を20minで2回目を行った

Results

(1)

＊培養

　　残り7本はアートに使用する

＊ミニプレ

表1: ミニプレ結果
	pSB1C3 1	pSB1C3 2
OD₂₆₀	0.581	0.592
DNA濃度	14525ng/μL	14800ng/μL
全量	31μL	33μL

＊制限酵素処理

　　なし

(2)

表2: ahpC、sufAの蛍光強度(1回目)
	ahpC 2	sufA 1	sufA 2
100nM	11.94	1.384	1.151
50nM	11.57	1.348	1.182
10nM	12.22	1.326	1.113
5nM	12.13	1.371	1.210
1nM	12.61	1.319	1.153

表3: ahpC、sufAの蛍光強度(2回目)
	ahpC 2	sufA 1	sufA 2
100nM	16.26	1.384	1.081
50nM	14.75	1.251	1.185
10nM	13.95	1.395	1.352
5nM	16.82	1.295	1.211
1nM	13.90	1.322	1.174

Consideration

(1)　問題なく結果を出せた

(2)　ahpC、sufA共に前回の実験で見られた、10nM前後の濃度で蛍光強度が大きくなる傾向が見られた

これはプロモータ自体の特性という可能性と実験操作のミスが主に考え得る

しかしながら、以前の大腸菌の生存曲線作成時、

作ってから日数のたった過酸化水素の各濃度ストックは揮発性により実験結果に影響が出たという事例がある

次回以降は、過酸化水素ストックの濃度、及び実験操作に留意し、実験を行う予定である

September 21

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 == September 20 ==
 <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
+:10：00～
+'''Member'''
+:竹内、革島、中村
+:Takeuchi,Kawashima,Nakamura
+'''Purpose'''
+:(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理　[革島]
+:(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定　[中村]
+'''Method'''
+:(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理
+::＊培養
+::　白金耳によるLB培地3mL(＋クロラムフェニコール)へのpSB1C3の培養
+::＊ミニプレ
+::　9/15カラム不使用のミニプレ参照
+::　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
+::＊制限酵素処理
+::　''EcoR''Ⅰ、''pst''Ⅰを3μL用い、Total　50μLで処理した
+:(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定
+::　Overnightで培養したahpC及びsufA各2本のO.D.<SUB>600</SUB>を測定した
+::　↓適正であったahpC1本とsufA2本をLB培地(+amp)でO.D.<SUB>600</SUB>が0.5になるように希釈した
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+::　↓ペレットをPBS150μLに溶かし、内100μLを蛍光強度測定に用いた
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+'''Consideration'''
+:(1)　問題なく結果を出せた
+:(2)　ahpC、sufA共に前回の実験で見られた、10nM前後の濃度で蛍光強度が大きくなる傾向が見られた
+::これはプロモータ自体の特性という可能性と実験操作のミスが主に考え得る
+::しかしながら、以前の大腸菌の生存曲線作成時、
+::作ってから日数のたった過酸化水素の各濃度ストックは揮発性により実験結果に影響が出たという事例がある
+::次回以降は、過酸化水素ストックの濃度、及び実験操作に留意し、実験を行う予定である
 == September 21 ==

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