Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September23

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*Amplifiable BAC plasmid([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) Purification
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*Amplifiable BAC plasmid ([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) purification
*Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
*Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
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*DH5αとMG1655へのBac Vecterのelectroporetion
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*Electroporetion of BAC plasmid into DH5α MG1655
== Bac Vecter Purification ==
== Bac Vecter Purification ==
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miniprepはQiagenのminiprep kit,qiaprepを用いて行った。
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Used Qiagen miniprep kit, qiaprep for miniprep
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1)昨日から培養してあったBac　Vector保有株を1.3ml,1.5mlエッペンチューブに移した。
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#Transfered 1.3 mL of BAC plasmid solution incubated overnight into 1.5 mL tube
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#Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
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2)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。
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#Discarded the supernatant and added remaining solution.
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#Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
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3)上澄みを捨て、残りのサンプルをチューブに移した。
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#Discarded the supernatant
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#Suspended on 250 uL of Buffer P1
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4)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。
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#Added 250 ul Buffer P2 inverted few times to mix, solution turned green
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#Added 350 ul Buffer N3 mixed by inversion, precipitation apeared
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5)上澄みを捨て、4℃で保存していたBuffer P1を250　ul加え、voltexにかけた。細胞塊は見えなくなった。
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#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 10min
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#Transfered the supernatant to filtration column
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6)Buffer P2を250 ul加え、静かに数回転倒混和した。溶液の色が緑色に変化した。
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#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
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#Discarded the flow-through
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7)Buffer N3を350 ul加え、すぐに数回転倒混和した。溶液が白濁した。
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#added 500 uL of Buffer PB  to filtration column
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#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
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8)4C,13000rpmで10min遠心した。
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#Discarded the flow-through centrifuged for 1min to remove remaining buffer
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#Transfered filtration column to a new 1.5 ml tube
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9)上澄みをピペットマンで専用のカラムに移し、4C,13000rpm,1min遠心した。
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#Resuspended on 50 ul of TE and incubated at RT for 1min
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#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
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10)下澄み液を捨て、500 ulのBuffer PBを加えて4C,13000rpm,1minで遠心を行った。
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#Stored at -20
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11)下澄み液を捨て、さらに1min遠心した。
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12)新しい1.5 ml チューブにカラムを移し、TEを50 ul加えて1min放置した。
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13)4C,13000rpm,1min遠心を行った。
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14)-20Cで凍結保存した。
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Revision as of 12:22, 21 October 2010

Notebook
  • Amplifiable BAC plasmid ([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) purification
  • Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
  • Electroporetion of BAC plasmid into DH5α MG1655

Bac Vecter Purification

Used Qiagen miniprep kit, qiaprep for miniprep

  1. Transfered 1.3 mL of BAC plasmid solution incubated overnight into 1.5 mL tube
  2. Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
  3. Discarded the supernatant and added remaining solution.
  4. Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
  5. Discarded the supernatant
  6. Suspended on 250 uL of Buffer P1
  7. Added 250 ul Buffer P2 inverted few times to mix, solution turned green
  8. Added 350 ul Buffer N3 mixed by inversion, precipitation apeared
  9. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 10min
  10. Transfered the supernatant to filtration column
  11. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
  12. Discarded the flow-through
  13. added 500 uL of Buffer PB to filtration column
  14. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
  15. Discarded the flow-through centrifuged for 1min to remove remaining buffer
  16. Transfered filtration column to a new 1.5 ml tube
  17. Resuspended on 50 ul of TE and incubated at RT for 1min
  18. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
  19. Stored at -20


AraC+RBS+pSB1A3のコロニーPCR

  1. コロニーを無作為に16個選び、番号を振った。
  2. 0.5 mLチューブを16本用意し、それぞれにDWを10 uLずつ分注した。
  3. チューブに番号を振り、対応するコロニーを懸濁した。
  4. コロニーPCR溶液を以下の組成に従って調整した。
Reagent Amount
Taq Master Mix 90 uL
Ex-F 1.8 uL
Ps-R 1.8 uL
Total 93.6 uL
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