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:(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]
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:(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[福山]
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::＊ライゲーション
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::　pSB1C3 + SufA
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::　　　 　+ SufA+GFP
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::　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
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::　↓16℃30min
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::＊トランスフォーメーション
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::　コンピテントセル100μLずつ加えた
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::　↓氷上30min
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::　↓42℃45min
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::　↓氷上2min
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::　↓SOC培地900μL加えた
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::　↓1h振とう培養
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::　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
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::　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
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::　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
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::　↓氷冷 15min.
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::　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
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::　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
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::　↓上清を捨てた
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::　↓70 % EtOHを50 µlを加えた
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::　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
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::　↓Remove sup.
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::　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
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::　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
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::　↓95 ℃,2 min加熱した
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::　↓氷冷(急冷)
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::　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
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::　↓シークエンス用のゴムのふたをした
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::　↓シークエンサーにいれた
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:(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
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::　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
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:(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
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::　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
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::＊PCR産物の確認
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::　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
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::　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
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::　↓135v,20minで電気泳動
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::　↓20minEtBr染色
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::　↓UV照射下でバンドの確認
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'''Results'''
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:(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
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:(2)　明日、シークエンスを確認
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:(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
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:(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、
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::ahpC…1482ng/μl
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::　　2…360ng/μl
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::sufA1…265ng/μl
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::　　2…425ng/μl
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::oxyR1…367ng/μl
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::　　2…369ng/μl
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::sodA1…427ng/μl
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::　　2…340ng/μl
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::yaiA1…267ng/μl
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::　　2…481ng/μl
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::acrAB1…368ng/μl
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::　　2…557ng/μl
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::dps1…530ng/μl
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::　　2…440ng/μl
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::だった(全量は全て19μl)
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::＊電気泳動
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::　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた
== October 4 ==
== October 4 ==

Revision as of 06:19, 24 October 2010


Contents

October 3

>>top

Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[福山]
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養　[福山]
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR　[竹内]

Method

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
＊ライゲーション
　pSB1C3 + SufA
　　　 　+ SufA+GFP
　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
　↓16℃30min
＊トランスフォーメーション
　コンピテントセル100μLずつ加えた
　↓氷上30min
　↓42℃45min
　↓氷上2min
　↓SOC培地900μL加えた
　↓1h振とう培養
　↓ストリーク
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
　↓氷冷 15min.
　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓上清を捨てた
　↓70 % EtOHを50 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓Remove sup.
　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
　↓95 ℃,2 min加熱した
　↓氷冷(急冷)
　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
　↓シークエンス用のゴムのふたをした
　↓シークエンサーにいれた
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
＊ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)0.75ul
テンプレートDNA0.5ul
MgSO42ul
dNTPs2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
Milli Q16.25ul
Total25ul
表2: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃61℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min∞
35サイクル
＊PCR産物の確認
　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
　↓135v,20minで電気泳動
　↓20minEtBr染色
　↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
(2)　明日、シークエンスを確認
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、
ahpC…1482ng/μl
　　2…360ng/μl
sufA1…265ng/μl
　　2…425ng/μl
oxyR1…367ng/μl
　　2…369ng/μl
sodA1…427ng/μl
　　2…340ng/μl
yaiA1…267ng/μl
　　2…481ng/μl
acrAB1…368ng/μl
　　2…557ng/μl
dps1…530ng/μl
　　2…440ng/μl
だった(全量は全て19μl)
＊電気泳動
　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

>>top

October 5

>>top

October 6

>>top

October 7

>>top

October 8

>>top

October 9

>>top
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