Template:KIT-Kyoto-September3

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Latest revision as of 15:54, 25 October 2010

September 3

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Time

9:00～

Member

福山,足立,吉村

Fukuyama,Adachi,Yoshimura

Purpose

DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Adachi]
Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Fukuyama]

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]

(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),

pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動　[福山]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理

　前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした

　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌）

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした

　↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解)

　↓1分間放置した

　↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出)

　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した

　↓上清をカラムに流した

　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μl加えた

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μl加えた

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた

　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した

　↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った

　　(値を右表1に示した)

　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った

　↓37℃で40分間インキュベートした

　↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった

表1: 吸光度
×1/100 pSB6A1
1回目	0.041
2回目	0.047
3回目	0.047
4回目	0.050
5回目	0.045
Ave.	0.046

表2: 試薬組成
DNA	10μl
EcoRⅠ	0.3μl
PstⅠ	0.3μl
M Buffer	6μl
Milli Q	7.4μl
Total	20μl

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理

　pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD₂₆₀で濁度を測定した

　濁度の測定結果を右表3に示す

　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度

　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×10²(μg/ml)と分かった

　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした

表3: 濁度
×1/100 pSB6A1
1回目	0.007
2回目	0.015
3回目	0.008
4回目	0.012
5回目	0.012
Ave.	0.0108

(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動

　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を

　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた

　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

Results

(1)　バンドが出なかった

(2)　pSB6A1(K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった

(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった

Consideration

(1)　試薬に問題ありか？

(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる

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 == September 3 ==
 <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
+:9:00～
+'''Member'''
+:福山,足立,吉村
+:Fukuyama,Adachi,Yoshimura
+'''Purpose'''
+# DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
+# pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Adachi]
+# Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Fukuyama]
+:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]
+:(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]
+:(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),
+::pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動　[福山]
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+:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理
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+::　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した
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+::　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した
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+::　↓溶出液を捨てた
+::　↓SolutionⅤを700μl加えた
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+::　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
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+::　濁度の測定結果を右表3に示す
+::　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度
+::　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×10<SUP>2</SUP>(μg/ml)と分かった
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+::　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた
+::　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した
+'''Results'''
+:(1)　バンドが出なかった
+:(2)　pSB6A1(K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった
+:(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した
+::pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した
+::pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した
+::pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった
+'''Consideration'''
+:(1)　試薬に問題ありか？
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