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August 25

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,古道,竹内,吉村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi]
Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi]
Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi]
DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(3日目)　[吉村]

(2)　大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)　[吉村]

(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー　[古道]

(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換　[古道]

(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation　[岩城、竹内]

(6)　pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),

pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出　[岩城、竹内]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた

(2)　過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる

　実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した

　DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した

　↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した

　↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした

　↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、

　　滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った

　↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー

　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の

　コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた

　↓37℃で振とう培養した

(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換

　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた

　↓氷上、30min

　↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた

　↓氷上、2min

　↓SOC培地0.9mlを加えた

　↓37℃で1時間振とう培養した

　↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)

(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation

EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと
EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、
ゲル抽出、ライゲーションを行った

dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた
↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った
↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした
↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした
↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、
　30μずつ、レーンにアプライした

↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した

＜試薬組成＞
DNAsol	30μL
M buffer	5μL
EcoRⅠ	1μL
XbaⅠ	1μL
H₂O	13μL
全量	50μL

(6)　大量培養後のアルカリミニプレップ

　以下の5種類のベクターを用意した

　　　　pSB3K3(J04450)

　　　　pSB6A1(K121013)

　　　　pSB1A2(E0240)

　　　　pSB1AK3(I732950)

　　　　pSB4A5(K193602)

　菌液をチューブに入る量だけ入れた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した

　↓solⅠ 4mLを加え、vortexした

　↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.

　↓solⅢを150μL加えon ice 5min.

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70%EtOHを200μL加えた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓遠心乾燥を行った

　↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した

Results

(1)　コロニー数を数えて以下の表にまとめた

H₂O₂濃度	0mM(control)	100nM	10nM	1nM	100pM	10pM	1pM
コロニー数	0	7	147	59	0	144	289

controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった

この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる

とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした

(2)　8月26日に結果を記載した

(3)　三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した

(4)　pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した

よって、8月27日の実験で使用することになった

(5)　ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、

ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった

pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった

(6)　すべてのプラスミドの濃度が低かった

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 '''Purpose'''
+:# The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
+:# The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
+:# Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi]
+:# Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi]
+:# Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi]
+:# DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi]
 :(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(3日目)　[吉村]
 :(2)　大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)　[吉村]