Template:KIT-Kyoto-Augsut13

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August 13

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,吉村,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi

Purpose

pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
Digested these and Ran on a Gel

pSB1A2(J44000)
pSB6A1(J04450)

(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする

(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出

(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、過熱した

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ

　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動

	pSB1A2(J44000)	pSB6A1(J04450)
XbaⅠ,PstⅠ	1μL	-
EcoRⅠ,SpeⅠ	-	1μL
(2)で得たpSB1A2 プラスミド	5μL	-
(2)で得たpSB6A1 プラスミド	-	5μL
H₂O	11μL	11μL
H Buffer	1μL	2μL
M Buffer	1μL	-
計	20μL	20μL

右の組成で1.5mlチューブ内で混合した

37℃で1時間インキュベートした

↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した

　(マーカーは1kbp radderを使用した)

↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した

↓泳動結果を写真で撮影した

Result

(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)

(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた

　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

Consideration

(1)

(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る

　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う

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 == August 13 ==
-【時間】
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
 :9:00～21:00
-【実験担当】
+'''Member'''
 :岩城,竹内,中村,吉村,足立
+:Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi
-【実験名】
-:(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション
-:(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
-:(3)　pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
-【実験目的】
+'''Purpose'''
-:(1)　LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
+#pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
-:(2)　pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
+#Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
-:(3)　DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
+#Digested these and Ran on a Gel
+:*pSB1A2(J44000)
+:*pSB6A1(J04450)
-【実験内容】
+:(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
-:(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション
+:(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
+:(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる
+'''Method'''
+:(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
 ::　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
 ::　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
 ::　↓on　ice　30min
-::　↓45℃で45sec、ヒートショックを行った
+::　↓45℃で45sec、過熱した
 ::　↓on　ice　2min
 ::　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
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 ::　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
-:(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
+:(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
-培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った
+::　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
-↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
+::　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
-↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
+::　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
-↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
+::　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
+::　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
-　　↓
+::　↓5min on ice
+::　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
-SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
+::　↓5min on ice
+::　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
-　　↓5min on ice
+::　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
+::　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
-SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
+::　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
+::　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
-　　↓5min on ice
+::　↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
+::　↓上澄みを捨てた
-℃、15,000rpm、10min遠心
+::　↓30秒間遠心乾燥を行った
+::　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
-　　↓
-上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
-　　↓
-等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
-　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心
-％EtOHを1mL加える(vortex)
-　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心
-上澄みを捨てる
-　↓30sec　遠心乾燥
-RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
-(3)
-＜組成1＞pSB1A2
-　XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL
-　(2)で得られたpSB1A2プラスミド・・・5μL
-　H2O・・・・・・・・11μL
-　H Buffer・・・・・・1μL
-　M Buffer・・・・・・1μL
-計20μL
-＜組成2＞pSB6A1
-　EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL
-　(2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL
-　H2O・・・・・・・・11μL
-　H Buffer・・・・・・2μL
-計20μL
-h,37℃でインキュベート
-　　　　　　　　↓
- Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
-(マーカーは1kbp radderを使用した)
-　　　　　　　　↓
-V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
-　　　　　　　　↓
+:(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
+::<TABLE BORDER="0"><TR>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD></TD><TD>pSB1A2(J44000)</TD><TD>pSB6A1(J04450)</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''Xba''Ⅰ,''Pst''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD><TD>-</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''EcoR''Ⅰ,''Spe''Ⅰ</TD><TD>-</TD><TD>1μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>(2)で得たpSB1A2<BR>プラスミド</TD><TD>5μL</TD><TD>-</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>(2)で得たpSB6A1<BR>プラスミド</TD><TD>-</TD><TD>5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>11μL</TD><TD>11μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>H Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>2μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>M Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>-</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>計</TD><TD>20μL</TD><TD>20μL</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
+::<TD>
+::右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
+::37℃で1時間インキュベートした
+::↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
+::　(マーカーは1kbp radderを使用した)
+::↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
+::↓泳動結果を写真で撮影した<BR></TD></TR></TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
-泳動結果を写真で撮影した
+'''Result'''
+:(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
+:(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
+::　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった
+'''Consideration'''
-【実験結果】
+:(1)
-(1)コロニーが２つだけ確認(ピンク)。(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。
+:(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
-　　pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。
+::　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う