"
Template:KIT-Kyoto-Augsut25
From 2010.igem.org
(Difference between revisions)
(→Augsut 25) |
(→August 25) |
||
| (7 intermediate revisions not shown) | |||
| Line 1: | Line 1: | ||
== August 25 == | == August 25 == | ||
| + | <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | ||
| + | '''Time''' | ||
| + | :9:00～21:00 | ||
| - | === | + | '''Member''' |
| + | :岩城,古道,竹内,吉村 | ||
| + | :Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura | ||
| + | |||
| + | '''Purpose''' | ||
| + | :# The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura] | ||
| + | :# The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura] | ||
| + | :# Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi] | ||
| + | :# Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi] | ||
| + | :# Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi] | ||
| + | :# DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi] | ||
| + | :(1) 大腸菌の生存曲線を調べる(3日目) [吉村] | ||
| + | :(2) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目) [吉村] | ||
| + | :(3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー [古道] | ||
| + | :(4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換 [古道] | ||
| + | :(5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation [岩城、竹内] | ||
| + | :(6) pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240), | ||
| + | ::pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出 [岩城、竹内] | ||
| + | |||
| + | '''Method''' | ||
| + | :(1) 大腸菌の生存曲線を調べる | ||
| + | :: プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた | ||
| + | |||
| + | :(2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる | ||
| + | :: 実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した | ||
| + | :: DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した | ||
| + | :: ↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した | ||
| + | :: ↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした | ||
| + | :: ↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、 | ||
| + | :: 滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った | ||
| + | :: ↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight) | ||
| + | |||
| + | :(3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー | ||
| + | :: pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の | ||
| + | :: コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた | ||
| + | :: ↓37℃で振とう培養した | ||
| + | |||
| + | :(4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換 | ||
| + | :: pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた | ||
| + | :: ↓氷上、30min | ||
| + | :: ↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた | ||
| + | :: ↓氷上、2min | ||
| + | :: ↓SOC培地0.9mlを加えた | ||
| + | :: ↓37℃で1時間振とう培養した | ||
| + | :: ↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight) | ||
| + | |||
| + | :(5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation | ||
| + | ::<TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | ::<TD> | ||
| + | EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと<BR> | ||
| + | EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、<BR> | ||
| + | ゲル抽出、ライゲーションを行った<BR> | ||
| + | <BR> | ||
| + | dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた<BR> | ||
| + | ↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った<BR> | ||
| + | ↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした<BR> | ||
| + | ↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした<BR> | ||
| + | ↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、<BR> | ||
| + | 30μずつ、レーンにアプライした<BR> | ||
| + | ↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した</TD> | ||
| + | ::<TD></TD><TD></TD> | ||
| + | ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | ::<TD>＜試薬組成＞</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>DNAsol</TD><TD>30μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>M buffer</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>13μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>全量</TD><TD>50μL</TD></TR> | ||
| + | ::</TABLE> | ||
| + | ::</TD></TR></TABLE> | ||
| + | |||
| + | :(6) 大量培養後のアルカリミニプレップ | ||
| + | :: 以下の5種類のベクターを用意した | ||
| + | :: pSB3K3(J04450) | ||
| + | :: pSB6A1(K121013) | ||
| + | :: pSB1A2(E0240) | ||
| + | :: pSB1AK3(I732950) | ||
| + | :: pSB4A5(K193602) | ||
| + | :: 菌液をチューブに入る量だけ入れた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した | ||
| + | :: ↓solⅠ 4mLを加え、vortexした | ||
| + | :: ↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min. | ||
| + | :: ↓solⅢを150μL加えon ice 5min. | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した | ||
| + | :: ↓70%EtOHを200μL加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓遠心乾燥を行った | ||
| + | :: ↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した | ||
| + | |||
| + | '''Results''' | ||
| + | :(1) コロニー数を数えて以下の表にまとめた | ||
| + | ::<TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | ::<TD>H<SUB>2</SUB>O<SUB>2</SUB>濃度</TD><TD>0mM(control)</TD><TD>100nM</TD><TD>10nM</TD><TD>1nM</TD><TD>100pM</TD><TD>10pM</TD><TD>1pM</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>コロニー数</TD><TD>0</TD><TD>7</TD><TD>147</TD><TD>59</TD><TD>0</TD><TD>144</TD><TD>289</TD></TR> | ||
| + | ::</TABLE> | ||
| + | ::controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった | ||
| + | ::この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる | ||
| + | ::とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした | ||
| + | :(2) 8月26日に結果を記載した | ||
| + | :(3) 三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した | ||
| + | :(4) pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した | ||
| + | ::よって、8月27日の実験で使用することになった | ||
| + | :(5) ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、 | ||
| + | ::ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった | ||
| + | ::pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった | ||
| + | ::(6) すべてのプラスミドの濃度が低かった | ||
Latest revision as of 11:21, 25 October 2010
August 25
Time
- 9:00～21:00
Member
- 岩城,古道,竹内,吉村
- Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura
Purpose
- The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
- The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
- Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi]
- Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi]
- Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi]
- DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi]
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(3日目) [吉村]
- (2) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目) [吉村]
- (3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー [古道]
- (4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換 [古道]
- (5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation [岩城、竹内]
- (6) pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),
- pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出 [岩城、竹内]
Method
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた
- (2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる
- 実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した
- DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した
- ↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した
- ↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした
- ↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、
- 滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った
- ↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)
- (3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー
- pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の
- コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた
- ↓37℃で振とう培養した
- (4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換
- pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた
- ↓氷上、30min
- ↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた
- ↓氷上、2min
- ↓SOC培地0.9mlを加えた
- ↓37℃で1時間振とう培養した
- ↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)
- (5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation
EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと
↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した
EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、
ゲル抽出、ライゲーションを行った
dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた
↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った
↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした
↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした
↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、
30μずつ、レーンにアプライした
＜試薬組成＞ DNAsol 30μL M buffer 5μL EcoRⅠ 1μL XbaⅠ 1μL H2O 13μL 全量 50μL
- (6) 大量培養後のアルカリミニプレップ
- 以下の5種類のベクターを用意した
- pSB3K3(J04450)
- pSB6A1(K121013)
- pSB1A2(E0240)
- pSB1AK3(I732950)
- pSB4A5(K193602)
- 菌液をチューブに入る量だけ入れた
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した
- ↓solⅠ 4mLを加え、vortexした
- ↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.
- ↓solⅢを150μL加えon ice 5min.
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた
- ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
- ↓70%EtOHを200μL加えた
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓遠心乾燥を行った
- ↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した
- (1) コロニー数を数えて以下の表にまとめた
H2O2濃度 0mM(control) 100nM 10nM 1nM 100pM 10pM 1pM コロニー数 0 7 147 59 0 144 289 - controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった
- この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる
- とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした
- (2) 8月26日に結果を記載した
- (3) 三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した
- (4) pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した
- よって、8月27日の実験で使用することになった
- (5) ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、
- ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった
- pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった
- (6) すべてのプラスミドの濃度が低かった
