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Template:KIT-Kyoto-Augsut21
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| + | ::pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した | ||
| + | :(2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、 | ||
| + | ::全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された | ||
| + | :(3) 十分なバンドを確認することができなかった。 | ||
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| + | '''Consideration''' | ||
| + | :(1) pSB6A1(K121013) → アルカリミニプレップのやり直し | ||
| + | :(3) テンプレートDNAはもっと少なくするべき | ||
| + | :: MgSO4は4 μlでやるべき | ||
| + | :: プライマーが間違っている可能性もあり | ||
Latest revision as of 10:47, 25 October 2010
August 21
Time
- 9:00～
Member
- 竹内、革島、足立、吉村
- Takeuchi,Kawashima,Adachi,Yoshimura
Title
- (1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動 [革島 ]
- (2) pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ [足立,吉村]
- (3) AcrAB,PoxyのPCR [竹内]
Purpose
- The insertion of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450) is confirmed.[Kawashima]
- DNA miniprep of pSB1A2(R0040) and pSB1A2(I13522).[Adachi,Yoshimura]
- PCR of AcrAB and OxyR.[Takeuchi]
- (1) DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
- (2) pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のプラスミド抽出
- (3) AcrAB,PoxyのPCR
Method
- (1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
- 8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、
- DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った
- pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),
- pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、
- それぞれLoading Buffer 1μLを加え6倍希釈にしコームに流した
- ↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った
- ↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
- ↓泳動結果を写真撮影した
- (2) pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ
- 8月20日(金)に培養したpSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
- ↓5分間、氷上で放置した
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
- ↓5分間、氷上で放置した
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
- ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心
- ↓30秒間、遠心乾燥を行った
- ↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAとした
- 制限酵素処理と電気泳動
右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した＜試薬組成＞ EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL プラスミドDNA
(DH５α(R0040),DH５α(I13522))5μL H2O 11μL H Buffer 2μL 計 20μL
- (3) AcrAB,PoxyのPCR
- 以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った
試薬組成 (1) (2) (3) テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL 2μL MgSO4 2μL 4μL 3μL primer F 1.5μL 1.5μL 1.5μL primer R 1.5μL 1.5μL 1.5μL KOD-Plusｰ 1μL 1μL 1μL H2O 33μL 31μL 32μL dNTPs 5μL 5μL 5μL total 50μL 50μL 50μL Pre Denature Denature Annealing Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 保持 35サイクル
- 結果は写真参照
Results
- (1) 写真の結果
- pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった
- →アルカリミニプレップのやり直し
- pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)
- pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した
- (2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、
- 全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された
- (3) 十分なバンドを確認することができなかった。
Consideration
- (1) pSB6A1(K121013) → アルカリミニプレップのやり直し
- (3) テンプレートDNAはもっと少なくするべき
- MgSO4は4 μlでやるべき
- プライマーが間違っている可能性もあり
