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Template:KIT-Kyoto-Augsut13
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| + | :: ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した | ||
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| + | :: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex) | ||
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| + | :: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した | ||
| + | :: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた | ||
| + | :: ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した | ||
| + | :: ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex) | ||
| + | :: ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みを捨てた | ||
| + | :: ↓30秒間遠心乾燥を行った | ||
| + | :: ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした | ||
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| + | :: pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった | ||
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| + | :(2,3) 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る | ||
| + | :: 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う | ||
Latest revision as of 10:59, 3 October 2010
August 13
Time
- 9:00～21:00
Member
- 岩城,竹内,中村,吉村,足立
- Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi
Purpose
- pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
- Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
- Digested these and Ran on a Gel
- pSB1A2(J44000)
- pSB6A1(J04450)
- (1) 12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
- (2) 前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
- (3) DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる
Method
- (1) pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
- -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
- ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
- ↓on ice 30min
- ↓45℃で45sec、過熱した
- ↓on ice 2min
- ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
- ↓37℃で1h、振とう培養した
- ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
- (2) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
- 培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
- ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
- ↓5min on ice
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
- ↓5min on ice
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
- ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
- ↓上澄みを捨てた
- ↓30秒間遠心乾燥を行った
- ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
- (3) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
pSB1A2(J44000) pSB6A1(J04450) XbaⅠ,PstⅠ 1μL - EcoRⅠ,SpeⅠ - 1μL (2)で得たpSB1A2
プラスミド5μL - (2)で得たpSB6A1
プラスミド- 5μL H2O 11μL 11μL H Buffer 1μL 2μL M Buffer 1μL - 計 20μL 20μL - 右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
- 37℃で1時間インキュベートした
- ↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
- (マーカーは1kbp radderを使用した)
- ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
- ↓泳動結果を写真で撮影した
Result
- (1) 2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
- (2,3) pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
- pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった
Consideration
- (1)
- (2,3) 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
- 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う
