Template:KIT-Kyoto-week10
From 2010.igem.org
(Difference between revisions)
Matsubara3 (Talk | contribs) |
(→October 13) |
||
(6 intermediate revisions not shown) | |||
Line 4: | Line 4: | ||
== October 11 == | == October 11 == | ||
- | |||
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | ||
+ | '''Time''' | ||
+ | :9:00~ | ||
- | + | '''Member''' | |
+ | :福山、竹内 | ||
+ | :Fukuyama,Takeuchi | ||
+ | '''Purpose''' | ||
+ | # DNA digestion of pSB6A1(ahpC,GFP) by restriction enzymes and isolation of DNA fragments from agarose gel and ligation and transformation. [Fukuyama] | ||
+ | :(1) pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション [福山] | ||
+ | :: ベクター :pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み) | ||
+ | :: インサート:ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み) | ||
+ | |||
+ | '''Method''' | ||
+ | :(1) 表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした | ||
+ | :: ↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした | ||
+ | :: ↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、 | ||
+ | :: さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた | ||
+ | :: ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた | ||
+ | :: ↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた | ||
+ | :: ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、乾燥させた | ||
+ | :: ↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った | ||
+ | :: ↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた | ||
+ | :: ↓フェノールを等量加え、ボルテックス | ||
+ | :: ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を回収した | ||
+ | :: ↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス | ||
+ | :: ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(''Eco''RⅠ,''pst''Ⅰでカット済み、CIAP処理済み) | ||
+ | :: の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない) | ||
+ | :: ↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた | ||
+ | :: ↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨てた | ||
+ | :: ↓70%エタノールを500 μl加えた | ||
+ | :: ↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨てた | ||
+ | :: ↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた | ||
+ | :: ↓16℃に30分間置いた | ||
+ | :: ↓DH5α懸濁液を100 μl加えた | ||
+ | :: ↓氷上に30分間置いた | ||
+ | :: ↓42℃に30分間置いた | ||
+ | :: ↓氷上に2分間置いた | ||
+ | :: ↓soc培地を900 μl加えた | ||
+ | :: ↓37℃で1時間振とう培養した | ||
+ | :: ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した | ||
+ | :: ↓37℃で一晩インキュベートした | ||
+ | <TABLE BORDER="1"><TR> | ||
+ | <TD COLSPAN="1">表1: 制限酵素処理</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>単位はμl</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>DNA溶液</TD><TD>88</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>1</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>Buffer H</TD><TD>10</TD></TR> | ||
+ | <TR> | ||
+ | <TD>全量</TD><TD>100</TD></TR> | ||
+ | </TABLE> | ||
+ | |||
+ | '''Results''' | ||
+ | :: 特に結果として記すものはなかった | ||
+ | |||
+ | == October 12 == | ||
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | ||
+ | '''Time''' | ||
- | + | '''Member''' | |
+ | :竹内 | ||
+ | :Takeuchi | ||
+ | '''Purpose''' | ||
+ | # Picking up single colony of pSB1C3(ahpC,GFP).[Takeuchi] | ||
+ | :(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ | ||
+ | |||
+ | '''Results''' | ||
+ | :(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ | ||
+ | :: 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが2つ見られたのでピックアップし、 | ||
+ | それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、 | ||
+ | 午前中から夕方までは37℃で振とう培養し、夕方からはovernightで室温で振とう培養した | ||
+ | |||
+ | '''Results''' | ||
+ | :(1) 特に結果として示せるものはなかった | ||
+ | |||
+ | == October 13 == | ||
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div> | ||
+ | '''Time''' | ||
+ | :12:00~ | ||
+ | |||
+ | '''Member''' | ||
+ | :福山 | ||
+ | :Fukuyama | ||
+ | |||
+ | '''Purpose''' | ||
+ | # DNA miniprep of pSB1C3(ahpC,GFP) and concentration.[Fukuyama] | ||
+ | # Concentrate of pSB1C3(ahpC)[Fukuyama] | ||
+ | :(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮 | ||
+ | :(2) pSB1C3(ahpC)の濃縮 | ||
+ | |||
+ | 【実験方法】 | ||
+ | :(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮 | ||
+ | :: LB液体培地で培養したpSB1C3(ahpC,GFP)を遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌 | ||
+ | :: ↓上清を捨てた | ||
+ | :: ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした | ||
+ | :: ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた | ||
+ | :: ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を新しいチューブに移した | ||
+ | :: ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた | ||
+ | :: ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた | ||
+ | :: ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた | ||
+ | :: ↓カラムにMilliQを100 μl加えた | ||
+ | :: ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた | ||
+ | :: ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた | ||
+ | :: ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、乾燥させた | ||
+ | :: ↓TE20 μl加えた | ||
+ | :: ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた | ||
+ | |||
+ | :(2) pSB1C3(ahpC)の濃縮 | ||
+ | :: ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた | ||
+ | :: ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*2) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた | ||
+ | :: ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm) | ||
+ | :: ↓上清を捨て、乾燥させた | ||
+ | :: ↓TE20 μl加えた | ||
+ | :: ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた | ||
+ | |||
+ | '''Results''' | ||
+ | :(1) 濃度は測らなかったが、(*1)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された | ||
+ | :(2) 濃度は測らなかったが、(*2)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された |
Latest revision as of 19:24, 25 October 2010
Contents[hide] |
October 10
No experiments.
October 11
Time
- 9:00~
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- DNA digestion of pSB6A1(ahpC,GFP) by restriction enzymes and isolation of DNA fragments from agarose gel and ligation and transformation. [Fukuyama]
- (1) pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション [福山]
- ベクター :pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
- インサート:ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
Method
- (1) 表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした
- ↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした
- ↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、
- さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
- ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた
- ↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
- ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った
- ↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた
- ↓フェノールを等量加え、ボルテックス
- ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を回収した
- ↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
- ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
- の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)
- ↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
- ↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を捨てた
- ↓70%エタノールを500 μl加えた
- ↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨てた
- ↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
- ↓16℃に30分間置いた
- ↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
- ↓氷上に30分間置いた
- ↓42℃に30分間置いた
- ↓氷上に2分間置いた
- ↓soc培地を900 μl加えた
- ↓37℃で1時間振とう培養した
- ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
- ↓37℃で一晩インキュベートした
表1: 制限酵素処理 | |
単位はμl | |
DNA溶液 | 88 |
EcoRⅠ | 1 |
PstⅠ | 1 |
Buffer H | 10 |
全量 | 100 |
Results
- 特に結果として記すものはなかった
October 12
Time
Member
- 竹内
- Takeuchi
Purpose
- Picking up single colony of pSB1C3(ahpC,GFP).[Takeuchi]
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ
Results
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ
- 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが2つ見られたのでピックアップし、
それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、 午前中から夕方までは37℃で振とう培養し、夕方からはovernightで室温で振とう培養した
Results
- (1) 特に結果として示せるものはなかった
October 13
Time
- 12:00~
Member
- 福山
- Fukuyama
Purpose
- DNA miniprep of pSB1C3(ahpC,GFP) and concentration.[Fukuyama]
- Concentrate of pSB1C3(ahpC)[Fukuyama]
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
- (2) pSB1C3(ahpC)の濃縮
【実験方法】
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
- LB液体培地で培養したpSB1C3(ahpC,GFP)を遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
- ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
- ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TE20 μl加えた
- ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた
- (2) pSB1C3(ahpC)の濃縮
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*2)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TE20 μl加えた
- ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた
Results
- (1) 濃度は測らなかったが、(*1)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された
- (2) 濃度は測らなかったが、(*2)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された