Template:KIT-Kyoto-Augsut15

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:9:00~18:00
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【実験担当】坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村
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:坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村
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【実験名】
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:Sakata,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura
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:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
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:(2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
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:(3)1%アガロースゲルの作成
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【実験目的】
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:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
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:(2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
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:(3)1%アガロースゲルの作成
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【実験内容】
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:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
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:培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
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:  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
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:上澄みをデカンテーションで取り除いた
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:  ↓
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:菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
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:  ↓
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:SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
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:  ↓5min on ice
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:SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
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:  ↓5min on ice
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:4℃、15,000rpm、10min遠心した
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:  ↓
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:上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
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:  ↓
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:等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
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:  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
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:70%EtOHを1mL加えた(vortex)
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:  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
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:上澄みを捨てた
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: ↓30sec 遠心乾燥した
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:RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
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:(2)pSB1のカットチェック
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'''Purpose'''
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::〈組成〉
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: 1. Miniprep pSB3K3(J04450)
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::pSB1A2 5μL
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: 2. Digested these and Ran on a Gel
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::EcoRⅠ 1μL
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::     ・pSB1A2(J44000)
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::PstⅠ         1μL
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::     ・pSB3K3(J04450)
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::Buffer(H) 1μL
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:(1) pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ
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::H2O  11μL
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:(2) pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)が大腸菌に挿入されているかどうか制限酵素処理によって確認する
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:: 計  20μL 
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::pSB3K3 5μL
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'''Method'''
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::EcoRⅠ 1μL
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:(1) pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ
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::PstⅠ 1μL
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:: 培養後のpSB3K3(J04450)を1.5mLエッペンチューブに取った
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::Buffer(H) 1μL
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:: ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
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::H2O  11μL
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:: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
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:: 計  20μL 
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:: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
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:: ↓5min on ice
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:: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
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:: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
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:: ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
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:: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
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:: ↓上澄みを捨てた
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:: ↓30sec 遠心乾燥した
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:: ↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
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:これを1h,37℃でインキュベートした
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: Loading Buffer 1μLを加えたものと、マーカー(1kbp radder)
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:1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
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:        ↓100V,30min泳動した
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【実験結果】
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::  マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gelのコームに流し込んだ<BR>
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:: ↓100V,30min泳動した<BR>
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:: ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した<BR>
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:: ↓泳動結果を写真で撮影した<BR>
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:(2)pSB1A2
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'''Results'''
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:  →4つ中2番にバンドが確認された。
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:(1) 抽出したプラスミドを冷蔵保存した
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:   2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
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:(2) pSB1A2
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:(3)pSB3K3
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:: →4つ中2番にバンドが確認された。
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:  →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された。
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::   2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した
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:   LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した。
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:(3) pSB3K3
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:: →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された
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::   LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した
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'''Consideration'''
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:(1) 翌日、制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する
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:(2) 翌日以降、培養を続けプラスミドを大量に回収する

Latest revision as of 23:08, 3 October 2010

August 15

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Time

9:00~18:00

Member

坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村
Sakata,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

1. Miniprep pSB3K3(J04450)
2. Digested these and Ran on a Gel
・pSB1A2(J44000)
・pSB3K3(J04450)
(1) pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ
(2) pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)が大腸菌に挿入されているかどうか制限酵素処理によって確認する

Method

(1) pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ
 培養後のpSB3K3(J04450)を1.5mLエッペンチューブに取った
 ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30sec 遠心乾燥した
 ↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
(2)pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)のカットチェック
<組成>
pSB1A25μLpSB3K35μL
EcoR1μLEcoR1μL
Pst1μLPst1μL
Buffer(H)1μLBuffer(H)1μL
H2O11μLH2O11μL
20μL20μL
 これを1h,37℃でインキュベートした
 ↓Loading Buffer 1μLを加えたものと、
  マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gelのコームに流し込んだ
 ↓100V,30min泳動した
 ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
 ↓泳動結果を写真で撮影した

Results

(1) 抽出したプラスミドを冷蔵保存した
(2) pSB1A2
 →4つ中2番にバンドが確認された。
   2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した
(3) pSB3K3
 →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された
   LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した

Consideration

(1) 翌日、制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する
(2) 翌日以降、培養を続けプラスミドを大量に回収する