Template:KIT-Kyoto-Augsut13

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(August 13)
(August 13 >>top)
 
(8 intermediate revisions not shown)
Line 1: Line 1:
== August 13 ==
== August 13 ==
-
【時間】
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
:9:00~21:00
:9:00~21:00
-
【実験担当】
+
'''Member'''
:岩城,竹内,中村,吉村,足立
:岩城,竹内,中村,吉村,足立
 +
:Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi
-
【実験名】
 
-
:(1) pSB3K3のトランスフォーメーション
 
-
:(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
 
-
:(3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
 
-
【実験目的】
+
'''Purpose'''
-
:(1) LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
+
#pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
-
:(2) pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
+
#Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
-
:(3) DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
+
#Digested these and Ran on a Gel
 +
:*pSB1A2(J44000)
 +
:*pSB6A1(J04450)
-
【実験内容】
+
:(1) 12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
-
:(1) pSB3K3のトランスフォーメーション
+
:(2) 前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
 +
:(3) DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる
 +
 
 +
'''Method'''
 +
:(1) pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
:: -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
:: -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
:: ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
:: ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
:: ↓on ice 30min
:: ↓on ice 30min
-
:: ↓45℃で45sec、ヒートショックを行った
+
:: ↓45℃で45sec、過熱した
:: ↓on ice 2min
:: ↓on ice 2min
:: ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
:: ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
Line 27: Line 31:
:: ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
:: ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
-
:(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
+
:(2) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
-
培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った
+
:: 培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
-
↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
+
:: ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
-
↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
+
:: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
-
↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
+
:: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
-
 
+
:: ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
-
  ↓
+
:: ↓5min on ice
-
 
+
:: ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
-
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
+
:: ↓5min on ice
-
 
+
:: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
-
  ↓5min on ice
+
:: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
-
 
+
:: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
-
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
+
:: ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
-
 
+
:: ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
-
  ↓5min on ice
+
:: ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
-
 
+
:: ↓上澄みを捨てた
-
4℃、15,000rpm、10min遠心
+
:: ↓30秒間遠心乾燥を行った
-
 
+
:: ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
-
  ↓
+
-
 
+
-
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
+
-
 
+
-
  ↓
+
-
 
+
-
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
+
-
 
+
-
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心
+
-
 
+
-
70%EtOHを1mL加える(vortex)
+
-
 
+
-
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心
+
-
 
+
-
上澄みを捨てる
+
-
 
+
-
 ↓30sec 遠心乾燥
+
-
 
+
-
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
+
-
 
+
-
 
+
-
(3)
+
-
<組成1>pSB1A2
+
-
 XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL
+
-
 
+
-
 (2)で得られたpSB1A2プラスミド・・・5μL
+
-
 
+
-
 H2O・・・・・・・・11μL
+
-
 
+
-
 H Buffer・・・・・・1μL
+
-
 
+
-
 M Buffer・・・・・・1μL
+
-
 
+
-
計20μL
+
-
 
+
-
 
+
-
 
+
-
 
+
-
<組成2>pSB6A1
+
-
 EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL
+
-
 
+
-
 (2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL
+
-
 
+
-
 H2O・・・・・・・・11μL
+
-
 
+
-
 H Buffer・・・・・・2μL
+
-
 
+
-
計20μL
+
-
 
+
-
 
+
-
 
+
-
 
+
-
1h,37℃でインキュベート
+
-
 
+
-
        ↓
+
-
 
+
-
Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
+
-
 
+
-
(マーカーは1kbp radderを使用した)
+
-
 
+
-
        ↓
+
-
 
+
-
100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
+
-
        ↓
+
:(3) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD></TD><TD>pSB1A2(J44000)</TD><TD>pSB6A1(J04450)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Xba''Ⅰ,''Pst''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD><TD>-</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ,''Spe''Ⅰ</TD><TD>-</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>(2)で得たpSB1A2<BR>プラスミド</TD><TD>5μL</TD><TD>-</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>(2)で得たpSB6A1<BR>プラスミド</TD><TD>-</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>11μL</TD><TD>11μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>2μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>-</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>計</TD><TD>20μL</TD><TD>20μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD>
 +
::右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
 +
::37℃で1時間インキュベートした
 +
::↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
 +
:: (マーカーは1kbp radderを使用した)
 +
::↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
 +
::↓泳動結果を写真で撮影した<BR></TD></TR></TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
-
泳動結果を写真で撮影した
+
'''Result'''
 +
:(1)  2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
 +
:(2,3) pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
 +
:: pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった
-
+
'''Consideration'''
-
【実験結果】
+
:(1)
-
(1)コロニーが2つだけ確認(ピンク)。(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。
+
:(2,3) 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
-
  pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。
+
:: 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う

Latest revision as of 10:59, 3 October 2010

August 13

>>top

Time

9:00~21:00

Member

岩城,竹内,中村,吉村,足立
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi


Purpose

  1. pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
  2. Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
  3. Digested these and Ran on a Gel
  • pSB1A2(J44000)
  • pSB6A1(J04450)
(1) 12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
(2) 前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
(3) DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

Method

(1) pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
 -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
 ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
 ↓on ice 30min
 ↓45℃で45sec、過熱した
 ↓on ice 2min
 ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
 ↓37℃で1h、振とう培養した
 ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
(2) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
 培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
 ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30秒間遠心乾燥を行った
 ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
(3) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
pSB1A2(J44000)pSB6A1(J04450)
XbaⅠ,Pst1μL-
EcoRⅠ,Spe-1μL
(2)で得たpSB1A2
プラスミド
5μL-
(2)で得たpSB6A1
プラスミド
-5μL
H2O11μL11μL
H Buffer1μL2μL
M Buffer1μL-
20μL20μL
右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
 (マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した

Result

(1)  2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
(2,3) pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
 pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

Consideration

(1)
(2,3) 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う