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Template:KIT-Kyoto-Augsut18
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::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる | ::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる | ||
Revision as of 04:04, 27 September 2010
August 18
Time
- 9:00～
Member
- 岩城、古道、竹内、中村
- Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る [中村]
- (2) pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る [中村,革島]
- (3) 作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認 [古道]
- (4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
- (5) 19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する [岩城]
- (6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養 [革島]
- (7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ [竹内]
Method
- (1) pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
- pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク
- ↓37℃でインキュベート（Overnight）
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
- pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク
- ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
- (3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
- 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
- ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
- ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
- ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
- ↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した
- (4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
- pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
- ↓37℃でインキュベート(Overnight)
- (5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
- pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
- ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
- (6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
- 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養
- (7) pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ
- 大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
- ↓比重計で、それぞれ等量を量った
- ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
- ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
- ↓遠心後、上清を捨てた
- ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
- ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
- ↓N3 4mLを加えた
- ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
- ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
- ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)
- ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
- ＊以降の操作は翌日に繰り越した
Result
- 19日に確認を行った結果を以下に示す
- (1) psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
- (3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
- (4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
- 前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
- (5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
- (6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
- (7) pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ
- →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
Consideration
- (1) pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
- これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
- (3)翌日、吸光度を測定する
- (4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
- pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。
