Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September24
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Revision as of 10:25, 24 September 2010
- Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
- miniprep後のサンプル泳動
Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
- 昨日懸濁しておいた菌を1 mLずつ1.5 mLチューブ2本に分注した。
- 4C,15000rpm,1minで遠心した。
- 上澄みを捨て、4Cで保存しておいたBuffer P1をそれぞれ125 uLずつ入れ、Voltexで撹拌した。
- Buffer N3を175 uLずつ入れ、すぐに転倒混和した。
- 4C,13000rpm,10min遠心した。
- 上澄みをデカントでカラムに移し、4C,13000rpm,1minで遠心した。
- 下澄み液を捨て、500 uLのBuffer PBを添加して、4C,13000rpm,1minで遠心した。
- 下澄みを捨て、さらに1min遠心した。
- 新しい1.5 mLチューブにカラムを移し、TEを50 uL入れ1min放置した後、1min遠心した。
miniprep後のサンプル泳動
1 uLのサンプルとloading buffer1 uL混ぜ、6 uLのλ/Hind Ⅲ EcoRⅠとともに泳動した。
マーカーとの比較からこのプラスミドは7000bp位の大きさだと思われる。
Arabinose Promoter+RBS+pSB1A3のbp数が3455bpなので、パーツ及びベクターを2個ずつ含むプラスミドであると考えられる。
この写真から、プラスミド溶液の濃度は30 ng/uL と推定した。
plasmidとGFP+double terminatorのdigestion
- 以下の組成で試薬を調整した。
Reagent | Amount |
---|---|
DW | 5.6 uL |
10x H Buffer | 1 uL |
0.1% BSA | 1 uL |
Spe I | 0.2 uL |
Pst I | 0.2 uL |
plasmid | 2 uL |
Total | 10 uL |
Transformation of BAC Vector
- Used DH5Alpha and MG1655 strains for electroporation
- Plated at 19:15
- Will be incubated for 18 h