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Template:KIT-Kyoto-Augsut25
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| + | 【実験内容】 | ||
| + | :(1) 大腸菌の生存曲線を調べる | ||
| + | :: プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた | ||
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| + | :(2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる | ||
| + | :: 実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した | ||
| + | :: DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した | ||
| + | :: ↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した | ||
| + | :: ↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした | ||
| + | :: ↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、 | ||
| + | :: 滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った | ||
| + | :: ↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight) | ||
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| + | :: コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた | ||
| + | :: ↓37℃で振とう培養した | ||
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| + | :: ↓氷上、30min | ||
| + | :: ↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた | ||
| + | :: ↓氷上、2min | ||
| + | :: ↓SOC培地0.9mlを加えた | ||
| + | :: ↓37℃で1時間振とう培養した | ||
| + | :: ↓400µlずつアンピシリン入りのLBプレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight) | ||
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| + | EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと<BR> | ||
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| + | :(6) 大量培養後のアルカリミニプレップ | ||
| + | :: 以下の5種類のベクターを用意した | ||
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| + | :: pSB6A1(K121013) | ||
| + | :: pSB1A2(E0240) | ||
| + | :: pSB1AK3(I732950) | ||
| + | :: pSB4A5(K193602) | ||
| + | :: 菌液をチューブに入る量だけ入れた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した | ||
| + | :: ↓solⅠ 4mLを加え、vortexした | ||
| + | :: ↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min. | ||
| + | :: ↓solⅢを150μL加えon ice 5min. | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した | ||
| + | :: ↓70%EtOHを200μL加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓遠心乾燥を行った | ||
| + | :: ↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した | ||
| + | |||
| + | 【実験結果】 | ||
| + | :(1) コロニー数を数えて以下の表にまとめた | ||
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| + | ::controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった | ||
| + | ::この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる | ||
| + | ::とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした | ||
| + | :(2) 8月26日に結果を記載した | ||
| + | :(3) 三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した | ||
| + | :(4) pSB1A2(BBa_I13507) ,pSB1A2(BBa_E0420)のトランスフォーメーションは成功した | ||
| + | ::よって、8月27日の実験で使用することになった | ||
| + | :(5) ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、 | ||
| + | ::ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった | ||
| + | ::(K121013 on pSB6A1のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった | ||
| + | ::(6) すべてのプラスミドの濃度が低かった | ||
Revision as of 02:17, 19 September 2010
August 25
【時間】
- 9:00～21:00
【実験担当】
- 岩城,古道,竹内,吉村
【実験名】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- (2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる
- (3) DH5α pSB1A2(BBa_I13507),DH5α pSB1A2(BBa_E0430),DH5α pSB1A2(BBa_J22005)のプレカルチャー
- (4) pSB1A2(BBa_I13507),pSB1A2(BBa_E0420),をDH5αに形質転換
- (5) dps,AcrAB-K121013 on pSB6A1のLigation(ベクターとプロモーターのカットチェックまで)
- (6) 大量培養後のアルカリミニプレップ
【実験目的】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(3日目)
- (2) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
- (3) DH5α pSB1A2(BBa_I13507),DH5α pSB1A2(BBa_E0430),DH5α pSB1A2(BBa_J22005)のプレカルチャー
- (4) pSB1A2(BBa_I13507),pSB1A2(BBa_E0420)をDH5αに形質転換
- (5) dps,AcrAB-K121013 on pSB6A1のLigation
- (6) pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),
- pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出
【実験内容】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた
- (2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる
- 実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した
- DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した
- ↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した
- ↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした
- ↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、
- 滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った
- ↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)
- (3) DH5α pSB1A2(BBa_I13507),DH5α pSB1A2(BBa_E0430),DH5α pSB1A2(BBa_J22005)のプレカルチャー
- DH5α pSB1A2(BBa_I13507),DH5α pSB1A2(BBa_E0430),DH5α pSB1A2(BBa_J22005)の
- コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた
- ↓37℃で振とう培養した
- (4) pSB1A2(BBa_I13507),pSB1A2(BBa_E0420),をDH5αに形質転換
- pSB1A2(BBa_I13507),pSB1A2(BBa_E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた
- ↓氷上、30min
- ↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた
- ↓氷上、2min
- ↓SOC培地0.9mlを加えた
- ↓37℃で1時間振とう培養した
- ↓400µlずつアンピシリン入りのLBプレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)
- (5) dps,AcrAB-K121013 on pSB6A1のLigation
EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと
↓ゲルのレーンには左2列にK121013 on pSB6A1を、右2列にdpsを流した
EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したK121013 on pSB6A1に電気泳動を行い、ゲル抽出、ライゲーションを行った
dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた
↓K121013 on pSB6A1の制限酵素処理を行った
↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした
↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした
↓dpsとK121013 on pSB6A1それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、30μずつ、レーンにアプライした
＜試薬組成＞ DNAsol 30μL M buffer 5μL EcoRⅠ 1μL XbaⅠ 1μL H2O 13μL 全量 50μL
- (6) 大量培養後のアルカリミニプレップ
- 以下の5種類のベクターを用意した
- pSB3K3(J04450)
- pSB6A1(K121013)
- pSB1A2(E0240)
- pSB1AK3(I732950)
- pSB4A5(K193602)
- 菌液をチューブに入る量だけ入れた
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した
- ↓solⅠ 4mLを加え、vortexした
- ↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.
- ↓solⅢを150μL加えon ice 5min.
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた
- ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
- ↓70%EtOHを200μL加えた
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓遠心乾燥を行った
- ↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した
- (1) コロニー数を数えて以下の表にまとめた
H2O2濃度 0mM(control) 100nM 10nM 1nM 100pM 10pM 1pM コロニー数 0 7 147 59 0 144 289 - controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった
- この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる
- とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした
- (2) 8月26日に結果を記載した
- (3) 三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した
- (4) pSB1A2(BBa_I13507) ,pSB1A2(BBa_E0420)のトランスフォーメーションは成功した
- よって、8月27日の実験で使用することになった
- (5) ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、
- ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった
- (K121013 on pSB6A1のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった
- (6) すべてのプラスミドの濃度が低かった
