Template:KIT-Kyoto-Augsut13

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【時間】　9:00～21:00
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【実験担当】岩城,竹内,中村,吉村,足立
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【実験名】
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:(1)pSB3K3のトランスフォーメーション
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:(2)pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
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:(3)pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
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【実験目的】
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:(1)LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーション をする
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:(2)pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
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:(3)DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
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【実験内容】
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:(1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解
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:　　DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを、1.5mLエッペンに混合
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:　　on　ice　30min
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:　　45℃で45sec、ヒートショック
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:　　各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
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:　　培養後、全量をLBプレート（+kan）に撒き、37℃でOvernight
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:(2)培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mL
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:　 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
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:上澄みをデカンテーションで取り除く
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:菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
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:SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
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:　　↓5min on ice
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:SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
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:4℃、15,000rpm、10min遠心
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:上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
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:等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
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:　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心
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:70％EtOHを1mL加える(vortex)
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:　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心
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:上澄みを捨てる
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:　↓30sec　遠心乾燥
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:RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
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:＜組成1＞pSB1A2
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:　XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL
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:　H Buffer・・・・・・1μL
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:　M Buffer・・・・・・1μL
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:計20μL
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:＜組成2＞pSB6A1
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:　EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL
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:　(2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL
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:　H2O・・・・・・・・11μL
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:　H Buffer・・・・・・2μL
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:計20μL
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:1h,37℃でインキュベート
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: Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
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:(マーカーは1kbp radderを使用した)
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:100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
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:泳動結果を写真で撮影した
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:【実験結果】
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:(1)コロニーが２つだけ確認(ピンク)。(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。
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:　　pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。
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Revision as of 04:46, 7 September 2010

Augsut 13

【時間】　9:00～21:00

【実験担当】岩城,竹内,中村,吉村,足立

【実験名】

(1)pSB3K3のトランスフォーメーション
(2)pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
(3)pSB1A2,pSB6A1の電気泳動

【実験目的】

(1)LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーション をする
(2)pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
(3)DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック

【実験内容】

(1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解
　　　　　　　　　　↓
　　DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを、1.5mLエッペンに混合
　　　　　　　　　　↓
　　on　ice　30min
　　　　　　　　　　↓
　　45℃で45sec、ヒートショック
　　　　　　　　　　↓
　　on　ice　2min
　　　　　　　　　　↓
　　各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
　　　　　　　　　　↓
　　37℃で1h、振とう培養
　　　　　　　　　　↓
　　培養後、全量をLBプレート（+kan）に撒き、37℃でOvernight
(2)培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mL
　 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
　　↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
　　↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
　　↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
　　↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
　　↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
　　↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70％EtOHを1mL加える(vortex)
　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
　↓30sec　遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
(3)
＜組成1＞pSB1A2
　XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL
　(2)で得られたpSB1A2プラスミド・・・5μL
　H2O・・・・・・・・11μL
　H Buffer・・・・・・1μL
　M Buffer・・・・・・1μL
計20μL
＜組成2＞pSB6A1
　EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL
　(2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL
　H2O・・・・・・・・11μL
　H Buffer・・・・・・2μL
計20μL
1h,37℃でインキュベート

　　　　　　　　↓

Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
　　　　　　　　↓
100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
　　　　　　　　↓
泳動結果を写真で撮影した
【実験結果】
(1)コロニーが２つだけ確認(ピンク)。(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。
　　pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。
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