Template:KIT-Kyoto-September4

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Latest revision as of 15:57, 25 October 2010

September 4

Time

9:00～

Member

岩城、福山

Iwaki,Fukuyama

Purpose

1. DNA miniprep of pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), and pSB6A1(E0430).[Fukuyama]
2. DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Iwaki]

(1)　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ　[福山]

(2)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出 　[岩城]

Method

(1)　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓このうち溶出液を1μlとって100倍希釈して吸光度を測定した

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓酢酸ナトリウム50 μlとフェノクロ800 μlを加えた

　↓25℃、14,500rpmで5分遠心した

　↓上清を回収した

　↓2-プロパノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓70 %エタノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓乾燥した

　↓30 μlの水に溶かした

　↓1kb ladderとともに、各試料から一部とって電気泳動した

(2)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出

　前日から10本の試験管（3 mlのLB培地(+Amp)）で37℃で一晩培養した

　↓チューブ10本にうつした

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓新しいチューブに移すのを忘れたため、これらを2本にまとめた

　↓酢酸ナトリウム50 μlとフェノクロ800 μlを加えた

　↓25℃、14,500rpmで5分遠心した

　↓上清を回収した

　↓2-プロパノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓70 %エタノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓乾燥した

　↓100 μlの水に溶かした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで20分間電気泳動した

　↓35分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

　↓100倍希釈して吸光度を計測した

Results

(1)　吸光度測定(260nm)の結果を下表1に示した

　　　表1:100倍希釈したもの

表1
	CFP-1	CFP-2	RFP-1	RFP-2	YFP-1	YFP-2
1回目	-0.024	-0.018	-0.024	-0.026	-0.011	-0.013
2回目	-0.022	-0.025	-0.02	-0.015	-0.009	-0.014
3回目	-0.016	-0.021	-0.027	-0.021	-0.016	-0.019
4回目	-0.023	-0.025	-0.021	-0.016	-0.016	-0.014
5回目	-0.024	-0.019	-0.029	-0.023	-0.012	-0.011
平均	-0.0218	-0.0216	-0.0242	-0.0202	-0.0128	-0.0142

いずれの試料もほぼDNAはないに等しかった

また、濃縮後に行った電気泳動でも6つの試料全て濃度が低かったようで、バンドは確認できなかった

(2)　電気泳動に関して

プラスミド溶液を5 μlと10 μl使用し電気泳動した

どちらでも薄いバンドしか確認できなかった

吸光度に関して

100倍希釈して5回計測した

1.531

-0.403

-0.217

-0.254

-0.192

Consideration

(1)　いずれの試料も、DNA濃度は、ないといえるほど非常に低いので、今後の実験には使えないと考えられる

(2)　電気泳動の結果と吸光度から、抽出したプラスミドの濃度は薄いと考えられる

ゲル抽出に使用してもおそらくバンドが出ないと予想される

抽出の過程でカラムを新しいチューブに乗せ換えるのを忘れたことによりロスが多かったと考えられる。

後日再度プラスミド抽出する必要がある

今回のサンプルは純度には問題がないので、後日抽出したサンプルと合わせて使用すればゲル抽出に使用可能である