Template:KIT-Kyoto-September2

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September 2

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Time

9:00～

Member

岩城,福山,古道,足立

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Adachi

Purpose

Concentration of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
Isolation of promoter DNA fragments from agarose gel.[Fukuyama]
Concentrate promoter DNA by Phenol/chloroform.[Adachi]
Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(I13507) fragments from agarose gel.[Furumichi]

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理　[福山]

(2)　プロモーターDNAのみを得る　[福山]

(3)　プロモーターDNAを精製する　[足立]

(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)

pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする　[古道]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理

　pSB6A1(K121013)の2試料(試料A,B)のうち、

　試料Aの一部を右表1,2の通りに制限酵素処理して135Vで15分間電気泳動した

　↓試料A,Bに酢酸ナトリウム200μL、イソプロパノール400μL(等量)を加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70%EtOHを200μL加えた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓遠心乾燥を行った

　↓これにMilliQ30μLを加えた

　↓表3の通りに各試薬を加えて37℃で3時間ほどインキュベートした

　　　　※試料Bはここまで(一晩インキュベート)

　↓CIAPを3μl加えて37℃で30分間インキュベートした　

　↓3-colors Indicatorを8μl加え、50Vで１時間電気泳動した

表1
DNA	10μl
Buffer H	2μl
EcoRⅠ	0.3μl
PstⅠ	0.3μl
MilliQ	7.4μl
total	20μl

表2
DNA	10μl
MilliQ	10μl
total	20μl

表3
DNA溶液	30μl
EcoRⅠ	0.5μl
PstⅠ	0.5μl
H Buffer	4μl
MilliQ	5μl
total	40μl

(2)　プロモーター(hemH,AcrAB,yaiA,SodA)のゲル抽出

　Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした

　↓1kbpマーカーとともに50Vで1時間電気泳動した

　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた

　↓ゲルの3倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベートし、2,3分毎に振り混ぜた

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを370μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓溶出液を新しいエッペンチューブにうつした　　　

(3)　プロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)のフェノクロ処理

＜材料＞

　PCR済みのプロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)

　H2O

　フェノールクロロホルム

　2-プロパノール

　70%ethanol

＜方法＞

　PCR後のDNAを以下の量エッペンに取り、全量600μlになるようH2Oを加え調節した

　hemH,OxyRについては、前回DNA量200μlでGEL抽出を行なおうとした際バンドが薄く抽出できなかったため、

　他のプロモーターのDNA量よりも増やした

	dps	SodA	yaiA	AcrAB	hemH	OxyR
DNA(μl)	200	200	200	200	400	400
H₂O(μl)	400	400	400	400	200	200
計(μl)	600

　↓CH3COONa 50μlを各エッペンに加えた。

　↓フェノールクロロホルムをエッペンの8割ぐらいまで入れた

　↓2，3回振ったのち、白濁するまでvoltexをした

　↓cfg,14500rpm,5min,Tr(室温)

　↓上清を回収したのち、2-プロパノールをエッペンの8割ぐらいまで加えた

　↓cfg,14500rpm,10min,4℃

　↓上清を捨て、70%ethanolをエッペンの8割ぐらいまで加えた

　↓cfg,14500rpm,3min,4℃

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機でペレットが乾燥するまで待った

　↓RNase in TE(10mg/ml)を各エッペンに30μlずつ加えた

(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)、

pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出

　一晩制限酵素処理したpSB6A1(K121013)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした

　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1(K121013)とpSB1A2(E0420)、

　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)を1％青ゲルに流し135Vで15分間電気泳動した

　↓バンドが検出されゲルの切り出しができそうなpSB1A2(E0420)

　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のゲルを切り出した

　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓保存した

Results

(1)　カットチェックは問題なかったが、ゲル抽出のための電気泳動後、

2本みえるはずのバンドが何故か4本確認できた。おかしな結果がでた試料Aは廃棄することにした

(2)　本当は最後は37μlのMilliQを加えるはずが、誤って370μl加えてしまった

今日は吸光度を計測しなかったので、濃度はまだ分かっていない

(3)　各プロモーターDNAを精製することができた

(4)　電気泳動の結果、pSB6A1(K121013)にはバンドが現れずまたは薄すぎて見えなかったのか、

ゲル抽出をすることができなかった。そのためpSB6A1(K121013)の濃縮を行う必要があった

その濃縮を実験内容(1)で行った

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 '''Purpose'''
-:(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理
+# Concentration of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
-:(2)　プロモーターDNAのみを得る
+# Isolation of promoter DNA fragments from agarose gel.[Fukuyama]
-:(3)　プロモーターDNAを精製する
+# Concentrate promoter DNA by Phenol/chloroform.[Adachi]
+# Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(I13507) fragments from agarose gel.[Furumichi]
+:(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理　[福山]
+:(2)　プロモーターDNAのみを得る　[福山]
+:(3)　プロモーターDNAを精製する　[足立]
 :(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)
-::pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする
+::pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする　[古道]
 '''Method'''