Template:KIT-Kyoto-Augsut20

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'''Time'''
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:9:00~
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=== No title ===
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'''Member'''
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【時間】 9:00~<BR>
+
:福山、古道、竹内、革島
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:Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima
-
【実験担当】福山、古道、竹内、革島<BR>
+
'''Title'''
-
+
:(1) 8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測 [古道]
-
【実験名】<BR>
+
:(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養 [革島]
-
(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR>
+
:(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ [福山]
-
(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー<BR>
+
:(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出 [福山、竹内]
-
(3)2%アガロースゲルの作成<BR>
+
 
-
(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ<BR>
+
'''Purpose'''
-
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
+
:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
-
+
:# Pre-culture pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040).[Kawashima]
-
【実験目的】<BR>
+
:# DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450).[Fukuyama]
-
(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR>
+
:# Isolation of pSB6A1(J04450) and pSB3K3(J04450) from agarose gel.[Fukuyama,Takeuchi]
-
(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出<BR>
+
:(1) 作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
-
(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
+
:(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養
-
+
:(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
-
【実験内容】<BR>
+
:(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
-
(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した<BR>
+
 
-
pUC19・・・・・0.005ng/μL<BR>
+
'''Method'''
-
pUC19・・・・・0.05ng/μL<BR>
+
:(1) コンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
-
pUC19・・・・・0.5ng/μL<BR>
+
:: 8/19(木)に以下の条件で形質転換を行い、
-
       ↓<BR>
+
:: コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
-
これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した<BR>
+
::   pUC19・・・・・0.005ng/μL
-
+
::   pUC19・・・・・0.05ng/μL
-
(2)プレカルチャー<BR>
+
::   pUC19・・・・・0.5ng/μL
-
DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR>
+
:: ↓これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した
-
DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR>
+
 
-
+
:(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のプレカルチャー
-
(3)2%アガロースゲルの作成<BR>
+
:: pSB1A2(I13522)を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
-
<組成><BR>
+
:: pSB1A2(R0040) を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
-
 ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL<BR>
+
 
-
 ・Ultra Pure Agarose・・・3g<BR>
+
:(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
-
+
:: 培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mLとった
-
<手順><BR>
+
:: ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
-
 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する<BR>
+
:: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
-
        ↓<BR>
+
:: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
-
 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む<BR>
+
:: ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
-
        ↓<BR>
+
:: ↓5min on ice
-
 ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する<BR>
+
:: ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
-
+
:: ↓5min on ice
-
(4)<BR>
+
:: ↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した
-
培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL<BR>
+
:: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
-
  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心<BR>
+
:: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
-
上澄みをデカンテーションで取り除く<BR>
+
:: ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
-
  ↓<BR>
+
:: ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
-
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)<BR>
+
:: ↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した
-
  ↓<BR>
+
:: ↓上澄みを捨てた
-
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)<BR>
+
:: ↓30秒間遠心乾燥を行った
-
  ↓5min on ice<BR>
+
:: ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
-
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)<BR>
+
 
-
  ↓5min on ice<BR>
+
:(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
-
4℃、15,000rpm、10min遠心<BR>
+
 
-
  ↓<BR>
+
:: <材料>
-
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す<BR>
+
::   プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
-
  ↓<BR>
+
::   1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
-
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える<BR>
+
::   TAE Buffer
-
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心<BR>
+
::   Buffer QG
-
70%EtOHを1mL加える(vortex)<BR>
+
::   Isopropanol
-
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心<BR>
+
::
-
上澄みを捨てる<BR>
+
:: 50Vで60分間電気泳動を行った
-
 ↓30sec 遠心乾燥<BR>
+
:: ↓1%アガロースゲルにEtBrを添加し20分間染色した
-
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする<BR>
+
:: ↓EtBrを取り除いた
-
+
:: ↓暗室、UV照射下でゲルのベクター部分を切り出した
-
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
+
:: ↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った
-
+
::    pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
-
・材料<BR>
+
::    pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
-
 プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)<BR>
+
:: ↓ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた
-
1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚<BR>
+
::    pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
-
TAE Buffer<BR>
+
::    pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
-
Buffer QG<BR>
+
:: ↓50℃のwater bathで10分間incubateした(4分毎にvoltex)
-
Isopropanol<BR>
+
:: ↓溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた
-
・実験操作<BR>
+
:: ↓カラムに移し替え、10,000rpmで1分間遠心した
-
50V、60minで電気泳動。<BR>
+
:: ↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた
-
          ↓<BR>
+
:: ↓10,000rpmで1分間遠心した
-
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。<BR>
+
:: ↓Buffer PE 0.75mLを加えた
-
          ↓ <BR>
+
:: ↓10,000rpmで1分間遠心した
-
EtBrを取り除いた。<BR>
+
:: ↓エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた
-
          ↓<BR>
+
:: ↓1,000rpmで1分間遠心した
-
暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。<BR>
+
:: ↓別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた
-
          ↓<BR>
+
::  (このエッペンの蓋は切っていない。)
-
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。<BR>
+
:: ↓10,000rpmで1分間遠心した
-
pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g<BR>
+
:: ↓別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈した
-
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g<BR>
+
 
-
          ↓<BR>
+
'''Result'''
-
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。<BR>
+
:(1) 測定したコロニー数
-
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL<BR>
+
:<TABLE BORDER="0"><TR>
-
pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL<BR>
+
:<TD>pUC19</TD><TD>0.005ng/μL</TD><TD>0個</TD></TR>
-
          ↓ <BR>
+
:<TR>
-
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)<BR>
+
:<TD>pUC19</TD><TD>0.05ng/μL</TD><TD>97個</TD><TD>  →1μLあたりのコロニー数は1940×10<SUP>3</SUP>個/μg</TD></TR>
-
             ↓<BR>
+
:<TR>
-
溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。<BR>
+
:<TD>pUC19</TD><TD>0.5ng/μL</TD><TD>1464個</TD><TD>  →1μLあたりのコロニー数は2928×10<SUP>3</SUP>個/μg</TD></TR>
-
          ↓<BR>
+
:<TR>
-
カラムに移し替え、10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
+
:<TD></TD><TD></TD><TD></TD><TD>平均値:2.4×10<SUP>6</SUP>CFU/μg(DH5αのコンピテンシー)</TD></TR>
-
          ↓<BR>
+
:</TABLE>
-
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。<BR>
+
 
-
          ↓<BR>
+
:(2) 十分な増殖が確認できた
-
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
+
:(3) 後日の電気泳動写真から十分な量のプラスミド抽出できたことが確認できた
-
          ↓<BR>
+
:(4) 十分な濃度の抽出を行うことができなかった
-
Buffer PE 0.75mLを加えた。<BR>
+
 
-
          ↓<BR>
+
'''Consideration'''
-
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
+
:(4) 濃縮作業がうまくいかなかったことが主要原因の一つであると考えられる
-
          ↓<BR>
+
::具体的には遠心時間が10分では足りないと考えられる
-
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。<BR>
+
::あるいは培養した大腸菌がすでにプラスミドを失って可能性がある
-
          ↓<BR>
+
::これより、遠心時間は10分より長くし、培養した試料を遅くとも翌日までには使うべきであると考えられる
-
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
+
-
          ↓<BR>
+
-
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。<BR>
+
-
(このエッペンの蓋は切っていない。)<BR>
+
-
          ↓<BR>
+
-
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
+
-
          ↓<BR>
+
-
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。<BR>
+
-
+
-
【実験結果】<BR>
+
-
(1)<BR>
+
-
コロニー数<BR>
+
-
pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個<BR>     
+
-
pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個     →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg<BR>
+
-
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個    →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg<BR>
+
-
+
-
平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)<BR>
+

Latest revision as of 10:40, 25 October 2010

August 20

>>top

Time

9:00~

Member

福山、古道、竹内、革島
Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima

Title

(1) 8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測 [古道]
(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養 [革島]
(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ [福山]
(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出 [福山、竹内]

Purpose

  1. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
  2. Pre-culture pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040).[Kawashima]
  3. DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450).[Fukuyama]
  4. Isolation of pSB6A1(J04450) and pSB3K3(J04450) from agarose gel.[Fukuyama,Takeuchi]
(1) 作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養
(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

Method

(1) コンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
 8/19(木)に以下の条件で形質転換を行い、
 コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
   pUC19・・・・・0.005ng/μL
   pUC19・・・・・0.05ng/μL
   pUC19・・・・・0.5ng/μL
 ↓これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した
(2) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のプレカルチャー
 pSB1A2(I13522)を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
 pSB1A2(R0040) を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
(3) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
 培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mLとった
 ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30秒間遠心乾燥を行った
 ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
(4) pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
 <材料>
   プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
   1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
   TAE Buffer
   Buffer QG
   Isopropanol
 50Vで60分間電気泳動を行った
 ↓1%アガロースゲルにEtBrを添加し20分間染色した
 ↓EtBrを取り除いた
 ↓暗室、UV照射下でゲルのベクター部分を切り出した
 ↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った
    pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
    pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
 ↓ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた
    pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
    pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
 ↓50℃のwater bathで10分間incubateした(4分毎にvoltex)
 ↓溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた
 ↓カラムに移し替え、10,000rpmで1分間遠心した
 ↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた
 ↓10,000rpmで1分間遠心した
 ↓Buffer PE 0.75mLを加えた
 ↓10,000rpmで1分間遠心した
 ↓エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた
 ↓1,000rpmで1分間遠心した
 ↓別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた
  (このエッペンの蓋は切っていない。)
 ↓10,000rpmで1分間遠心した
 ↓別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈した

Result

(1) 測定したコロニー数
pUC190.005ng/μL0個
pUC190.05ng/μL97個  →1μLあたりのコロニー数は1940×103個/μg
pUC190.5ng/μL1464個  →1μLあたりのコロニー数は2928×103個/μg
平均値:2.4×106CFU/μg(DH5αのコンピテンシー)
(2) 十分な増殖が確認できた
(3) 後日の電気泳動写真から十分な量のプラスミド抽出できたことが確認できた
(4) 十分な濃度の抽出を行うことができなかった

Consideration

(4) 濃縮作業がうまくいかなかったことが主要原因の一つであると考えられる
具体的には遠心時間が10分では足りないと考えられる
あるいは培養した大腸菌がすでにプラスミドを失って可能性がある
これより、遠心時間は10分より長くし、培養した試料を遅くとも翌日までには使うべきであると考えられる