Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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August 18

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Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]

(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]

(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]

Method

(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク

　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベート（Overnight）

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた

　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション

　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベート(Overnight)

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す

(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった

(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、

前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ

　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。

これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる

(3)翌日、吸光度を測定する

(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。

pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。

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 == August 18 ==
-【時間】
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
 :9:00～
-【実験担当】
+'''Member'''
 :岩城、古道、竹内、中村
+:Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
-【実験名】
+'''Purpose'''
-:(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
+:# Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
-:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
+:# Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
-:(3)　コンピタントセルの調整(17日の続き)
+:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
-:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
+:# Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
-:(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(前日の大量培養がコンタミした為)
+:# Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
-:(6)　pSB1A2の大量培養
+:# Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
-:(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
+:# DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
+:(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]
+:(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]
+:(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]
+:(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]
+:(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]
-【実験目的】
+'''Method'''
-:(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る
+:(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
-:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
+::　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク
-:(3)　作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
+::　↓37℃でインキュベート（Overnight）
-:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
-:(5)　19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
-:(6)　pSB1A2の大量培養
-:(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
-【実験内容】
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
-:(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
+::　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク
-::　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリークした
 ::　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
-:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
+:(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
-::　BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリークした
-::　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
-:(3)　コンピタントセルの調整
 ::　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
 ::　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
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 ::　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した
-:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
-::　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした
+::　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
 ::　↓37℃でインキュベート(Overnight)
-:(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー
+:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
 ::　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
-::　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
+::　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
-:(6)　pSB1A2の大量培養
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
-::　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及びpSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ)に大量培養
+::　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養
-:(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
+:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ
-::　大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
+::　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
 ::　↓比重計で、それぞれ等量を量った
-::　↓各チューブを4℃、4000×gで10min　遠心した
+::　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
 ::　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
 ::　↓遠心後、上清を捨てた
-::　↓沈殿にR3を4mLを加えてVortexを行った
+::　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
-::　↓L7を4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置した
+::　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
-::　↓N3を4mLを加えた
+::　↓N3 4mLを加えた
-::　↓室温、12,000×gで10min遠心した
+::　↓室温、12,000rpmで10min遠心した
 ::　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
 ::　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)
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 :＊以降の操作は翌日に繰り越した
-【実験結果】
+'''Result'''
 :19日に確認を行った結果を以下に示す
-:(1)　BBa-K121013に関しては、シングルコロニーが得られたが、BBa-K193602はシングルコロニーが得られなかった
+:(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
-:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
 :(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
-:(4)　R0040(1-6I)、I13522[2-(8A)]をトランスフォーメーション後、培養した結果、
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
 ::前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
-:(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー→培養完了
+:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
-:(6)　pSB1A2の大量培養→培養完了
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
-:(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ→電気泳動で確認
+:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ
-::＊写真参照
+::　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
-【考察】
+'''Consideration'''
-:(1)　BBa-K193602は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかった
+:(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
-::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったと考えられる
+::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
-:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
+:(3)翌日、吸光度を測定する
-:(4)　R0040（1-6I）が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる
+:(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
-::I13522[2-(8A)]に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある
+::pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。