Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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【時間】 9:00~
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:岩城、古道、竹内、中村
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:Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
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【実験担当】岩城、古道、竹内、中村
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'''Purpose'''
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:# Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
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【実験名】
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:# Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
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(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
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:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
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(2)BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
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:# Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
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(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
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:# Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
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(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
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:# Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
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(5)pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(←前日の大量培養がコンタミした為)
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:# DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
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(6)pSB1A2の大量培養
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:(1) pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る [中村]
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(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
+
:(2) pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る [中村,革島]
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【実験目的】
+
:(3) 作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認 [古道]
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(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る
+
:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
-
(2)BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
+
:(5) 19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する [岩城]
-
(3)作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
+
:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養 [革島]
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(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
+
:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ [竹内]
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(5)19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
+
 
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(6)pSB1A2の大量培養
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'''Method'''
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(7)pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
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:(1) pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
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:: pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート(+amp)にストリーク
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:: ↓37℃でインキュベート(Overnight)
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
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:: pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート(+amp)にストリーク
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:: ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
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:(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
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:: 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
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:: ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
 +
:: ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
 +
:: ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
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:: ↓O.D=0.4~0.8になるように調節した
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:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
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:: pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
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:: ↓37℃でインキュベート(Overnight)
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:(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
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:: pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
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:: ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
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:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
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:: 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+Cam)に大量培養
   
   
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【実験内容】
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:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミディプレ
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(1)BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリーク
+
:: 大量培養させておいたpSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
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              ↓
+
:: ↓比重計で、それぞれ等量を量った
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  37℃でインキュベート(Overnight)
+
:: ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
-
+
:: ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
-
+
:: ↓遠心後、上清を捨てた
-
(2)BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリーク
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:: ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
-
              ↓
+
:: ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
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  37℃でインキュベート(Overnight)
+
:: ↓N3 4mLを加えた
-
+
:: ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
-
(3)前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
+
:: ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
-
          ↓
+
:: ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
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  SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養
+
:: ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
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          ↓
+
 
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  その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養
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:*以降の操作は翌日に繰り越した
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          ↓
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  吸光度測定した(*実際は牛島さんに測っていただいた)
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'''Result'''
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:19日に確認を行った結果を以下に示す
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(4)l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした
+
 
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             ↓
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:(1) psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
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  37℃でインキュベート(Overnight)
+
 
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
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(5)pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
+
 
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             ↓
+
:(3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
-
  pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
+
 
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:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
-
(6)前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養
+
::前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
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+
 
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(7)大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
+
:(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
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         ↓
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  比重計で、それぞれ等量を量った
+
:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
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         ↓
+
 
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  各チューブを4℃、4000×gで10min 遠心
+
:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ
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         ↓
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::  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
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  この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
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         ↓
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'''Consideration'''
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  遠心後、上清を捨てた
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:(1) pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
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         ↓
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::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
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  沈殿にR3 4mLを加えて、Vortex
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         ↓
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
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  L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置
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         ↓
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:(3)翌日、吸光度を測定する
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  N3 4mLを加えた
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         ↓
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:(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
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  室温、12,000×gで10min遠心
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::pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。
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         ↓
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  上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
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         ↓
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  カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
+
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         ↓
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  カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
+
-
*以降の操作は翌日に繰り越し
+

Latest revision as of 10:26, 25 October 2010

August 18

>>top

Time

9:00~

Member

岩城、古道、竹内、中村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
  2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
  3. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
  4. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
  5. Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
  6. Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
  7. DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
(1) pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る [中村]
(2) pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る [中村,革島]
(3) 作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認 [古道]
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
(5) 19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する [岩城]
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養 [革島]
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ [竹内]

Method

(1) pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
 pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート(+amp)にストリーク
 ↓37℃でインキュベート(Overnight)
(2) pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
 pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート(+amp)にストリーク
 ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
 ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
 ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
 ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
 ↓O.D=0.4~0.8になるように調節した
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
 pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
 ↓37℃でインキュベート(Overnight)


(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
 pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
 ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+Cam)に大量培養
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミディプレ
 大量培養させておいたpSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
 ↓比重計で、それぞれ等量を量った
 ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
 ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
 ↓遠心後、上清を捨てた
 ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
 ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
 ↓N3 4mLを加えた
 ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
 ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
 ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
 ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
*以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す
(1) psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
(2) pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
(3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ
  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1) pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
(2) pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
(3)翌日、吸光度を測定する
(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。