Template:KIT-Kyoto-Augsut18

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)

Latest revision as of 10:26, 25 October 2010

August 18

>>top

Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]

(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]

(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]

Method

(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク

　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベート（Overnight）

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた

　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション

　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベート(Overnight)

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す

(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった

(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、

前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ

　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。

これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる

(3)翌日、吸光度を測定する

(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。

pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。

@@ Line 1: / Line 1: @@
 == August 18 ==
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
+:9:00～
-=== No title ===
+'''Member'''
-【時間】　9:00～
+:岩城、古道、竹内、中村
+:Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
-【実験担当】岩城、古道、竹内、中村
+'''Purpose'''
+:# Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
-【実験名】
+:# Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
-(1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のストリーク
+:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
-(2)BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
+:# Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
-(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
+:# Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
-(4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション
+:# Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
-(5)pSB3K3、pSB6のプレカルチャー（←前日の大量培養がコンタミした為）
+:# DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
-(6)pSB1A2の大量培養
+:(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]
- (7)pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
+:(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]
-【実験目的】
+:(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]
-(1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のシングルコロニーを得る
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]
-(2)BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
+:(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]
-(3)作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]
-(4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション
+:(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]
-(5)19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
-(6)pSB1A2の大量培養
+'''Method'''
-(7)pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
+:(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
+::　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク
+::　↓37℃でインキュベート（Overnight）
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
+::　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク
+::　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
+:(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
+::　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
+::　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
+::　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
+::　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
+::　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
+::　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
+::　↓37℃でインキュベート(Overnight)
+:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
+::　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
+::　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
+::　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養
-【実験内容】
+:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ
-(1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）をLBプレート（+amp）にストリーク
+::　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
-　　　　　　　　　　　　　　↓
+::　↓比重計で、それぞれ等量を量った
-℃でインキュベート（Overnight）
+::　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
+::　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
+::　↓遠心後、上清を捨てた
-(2)BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート（+amp）にストリーク
+::　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
-　　　　　　　　　　　　　　↓
+::　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
-℃でインキュベート（Overnight）
+::　↓N3 4mLを加えた
+::　↓室温、12,000rpmで10min遠心した
-(3)前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
+::　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
-　　　　　　　　　　↓
+::　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)
-　　SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養
+::　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
-　　　　　　　　　　↓
-　　その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養
+:＊以降の操作は翌日に繰り越した
-　　　　　　　　　　↓
-　　吸光度測定した（＊実際は牛島さんに測っていただいた）
+'''Result'''
+:19日に確認を行った結果を以下に示す
-(4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）をDH5αにトランスフォーメーションした
-　　　　　　　　　　　　　↓
+:(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
-℃でインキュベート（Overnight）
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
-(5)pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
-　　　　　　　　　　　　　↓
+:(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
-　　pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地（l）（+Km）、LB培地（l）（+amp）に植え継ぎ、37℃で振とう培養
+:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
-(6)前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ）に大量培養
+::前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
-(7)大量培養させておいたpSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
+:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
-　　　　　　　　　↓
-　　比重計で、それぞれ等量を量った
+:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
-　　　　　　　　　↓
-　　各チューブを4℃、4000×gで10min　遠心
+:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ
-　　　　　　　　　↓
+::　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
-　　この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
-　　　　　　　　　↓
+'''Consideration'''
-　　遠心後、上清を捨てた
+:(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
-　　　　　　　　　↓
+::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
-　　沈殿にR3 4mLを加えて、Vortex
-　　　　　　　　　↓
+:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
-　　L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置
-　　　　　　　　　↓
+:(3)翌日、吸光度を測定する
-　　N3 4mLを加えた
-　　　　　　　　　↓
+:(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
-　　室温、12,000×gで10min遠心
+::pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。
-　　　　　　　　　↓
-　　上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
-　　　　　　　　　↓
-　　カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した（×２）
-　　　　　　　　　↓
-　　カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
-＊以降の操作は翌日に繰り越し