Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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:岩城、古道、竹内、中村
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:# Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
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:# Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
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:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
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:# Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
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:# Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
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:# Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
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:# DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
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:(1) pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る [中村]
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:(2) pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る [中村,革島]
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:(3) 作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認 [古道]
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:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
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:(5) 19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する [岩城]
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:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養 [革島]
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:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ [竹内]
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:(1) pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
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:: pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート(+amp)にストリーク
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:: ↓37℃でインキュベート(Overnight)
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
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:: pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート(+amp)にストリーク
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:: ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
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:(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
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:: 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
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:: ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
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:: ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
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:: ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
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:: ↓O.D=0.4~0.8になるように調節した
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:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
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:: pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
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:: ↓37℃でインキュベート(Overnight)
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:(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
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:: pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
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:: ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
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:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
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:: 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+Cam)に大量培養
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:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミディプレ
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:: 大量培養させておいたpSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
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:: ↓比重計で、それぞれ等量を量った
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:: ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
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:: ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
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:: ↓遠心後、上清を捨てた
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:: ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
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:: ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
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:: ↓N3 4mLを加えた
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:: ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
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:: ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
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:: ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
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:: ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
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:*以降の操作は翌日に繰り越した
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'''Result'''
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:19日に確認を行った結果を以下に示す
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:(1) psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
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:(3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
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:(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
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::前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
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:(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
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:(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
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:(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ
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::  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
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'''Consideration'''
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:(1) pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
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::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
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:(2) pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
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:(3)翌日、吸光度を測定する
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:(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
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::pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。

Latest revision as of 10:26, 25 October 2010

August 18

>>top

Time

9:00~

Member

岩城、古道、竹内、中村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
  2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
  3. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
  4. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
  5. Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
  6. Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
  7. DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
(1) pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る [中村]
(2) pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る [中村,革島]
(3) 作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認 [古道]
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
(5) 19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する [岩城]
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養 [革島]
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ [竹内]

Method

(1) pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
 pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート(+amp)にストリーク
 ↓37℃でインキュベート(Overnight)
(2) pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
 pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート(+amp)にストリーク
 ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
(3)コンピタントセルの調整(17日の続き)
 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
 ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
 ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
 ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
 ↓O.D=0.4~0.8になるように調節した
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
 pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
 ↓37℃でインキュベート(Overnight)


(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
 pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
 ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+Cam)に大量培養
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミディプレ
 大量培養させておいたpSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
 ↓比重計で、それぞれ等量を量った
 ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
 ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
 ↓遠心後、上清を捨てた
 ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
 ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
 ↓N3 4mLを加えた
 ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
 ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
 ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
 ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
*以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す
(1) psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
(2) pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
(3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
(4) pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
(5) pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
(6) pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
(7) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ
  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1) pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
(2) pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
(3)翌日、吸光度を測定する
(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。