Template:KIT-Kyoto-week8
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- | :: 表2の通りにDNA溶液に制限酵素, | + | :: 表2の通りにDNA溶液に制限酵素,バッファーとMilliQを加えて、 |
+ | :: それぞれ全量が25 μlになるようにした(DNAはそれぞれ約100 μgになっている) | ||
:: ↓overnightで37℃に置いた | :: ↓overnightで37℃に置いた | ||
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Contents[hide] |
September 26
Time
- 9:00~
Member
- 福山,臼井,革島,中村
- Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura
Purpose
- (1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理 [革島]
- (2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理 [中村]
- (3) pSB1C3のゲル抽出 [福山]
- (4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験 [臼井]
Method
- (1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理
- *ミニプレ
- 9/15カラム不使用のミニプレ参照
- 最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
- *制限酵素処理
- pSB1C3:DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(8本)
- promoter less RFP:DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(3本)
- (2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理
- 各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)
- の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)
- </TR>
表1: 制限酵素処理試薬組成 acrAB ahpC dps oxyR sodA sufA yaiA DNAsol 8.8μL 5.5μL 8.56μL 7.1μL 6.96μL 8.7μL 6.2μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL 10xH 2.5μL Milli Q Final 25μLに調整
- (3) pSB1C3のゲル抽出
- 4種類の濃度(3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料)
- pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた
- ↓前日に作成した1%青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した
- 確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1%アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
- ↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した
- ↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
- ↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
- ↓フェノールを430 μlほど加えた
- ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
- ↓上清を回収
- ↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
- ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
- ↓上清を回収
- ↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
- ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μlずつ加えた
- ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TEを11 μlずつ加えた
- ↓冷凍庫で保存
- (4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験
- 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
- ↓終濃度がlessおよび1nM~1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
- ↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
- ↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min
- ↓上清を除いた
- ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
- ↓全量を蛍光強度測定に用いた
- ※この操作を80分まで行った
Results
- (1)
表2: 濁度測定 RFP 1 RFP 2 RFP 3 RFP 4 RFP 5 RFP 6 RFP 7 pSB1C3 OD260 0.753 0.589 0.756 0.505 0.503 0.517 0.456 0.570 DNA濃度 18825 14725 18825 12625 12591 12925 11400 14250 全量 28 29 29 29 29 29 29 29
- (2)明日、ゲル抽予定
- (3)吸光度をまだ測っていないので、ゲル抽出が上手くいったのかはわからない
Consideration
- (1) 問題なく実験はうまくいった
- (3) 今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
- 今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。
- (4) 29日の実験ノートに結果を添付
September 27
Time
- 9:00~
Member
- 岩城、福山、古道、臼井、革島、中村、吉村
- Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) 前日培養しておいた、dps+GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ [古道]
- (2) (1)でミニプレップ処理をしたdps+GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理 [古道]
- (3) 9月26日の(3)の続き ― pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定 [福山]
- (4) acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出 [福山]
- (5) ベクターpSB1C3,インサートSufA+GFP,OxyR,SodA,yaiAのライゲーションとトランスフォーメーション [福山]
- (6) TetR,K121013の蛍光強度測定 [臼井、中村]
Method
- (1) 前日培養しておいた、dps+GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ
- 1.5mlエッペンチューブに集菌
- ↓SolutionⅠを100µl加えボルテックスし常温で5分放置
- ↓SolutionⅡを200µl加え混ぜ氷上に5分放置(これ以降はボルテックスをしない)
- ↓SolutiionⅢを150µl加え混ぜ氷上に5分放置
- ↓cfg 4℃、15,000rpm、5分
- ↓上清を回収しそれに100%エタノールを1ml加え混ぜた
- ↓常温10分放置
- ↓cfg 4℃、15,000rpm、12分
- ↓上清を捨て沈殿に70%エタノールを500μl加えた
- ↓cfg 4℃、15,000rpm、3分
- ↓エタノールを除き2分遠心乾燥させた
- ↓RNase入りTEを30µl加え溶解した
- ↓各吸光度を測定した
- (2) (1)でミニプレップ処理をしたdps+GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理
- 以下の組成に従い制限酵素処理を行った
- ↓37℃、一晩、インキュベートした
表1: 制限酵素処理 dps AcrAB ahpC DNA 20μl 20μl 15µl Buffer H 5µl 5µl 5µl H2O 23µl 23µl 28μl XbaⅠ 1µl 1µl 1µl PstⅠ 1µl 1µl 1µl
- (3) pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定
- 9月26日の(3)で得たpSB1C3の7試料(各試料の全量11 μl)をそれぞれ1 μlとって100倍希釈で吸光度測定を行った
- (4) acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出
- acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3それぞれに5倍希釈で
- Loading Bufferを加えた
- ↓それぞれを低融点アガロース1%ゲルにアプライし、50Vで1時間電気泳動した
- ↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
- ↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
- ↓フェノールを430 μlほど加えた
- ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
- ↓上清を回収
- ↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
- ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
- ↓上清を回収
- ↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
- ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μlずつ加えた
- ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓pSB1C3(*1)にTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をSufAにいれて溶かした→溶液(*2)
- OxyRにTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をpSB1C3(*2)にいれて溶かした→溶液(*3)
- (5) 下表1の通りに溶液を調整した
- ↓16℃で30分間インキュベートした
- ↓各試料にDH5α懸濁液150 μlずつ加えた
- ↓氷上で3分放置
- ↓43℃下に30秒置いた
- ↓soc培地を900 μlずつ加えた
- ↓集菌してクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた
- ↓37℃,overnightでインキュベート
表2: 試薬組成(単位は μl) 試料1 試料2 試料3 試料4 試料5 pSB1C3 (*2)全量 (*3)全量 0.5 2 1 Suf+GFP (*2)全量 0 OxyR (*3)全量 3.9 yaiA 5.6 SodA 9 MilliQ 5.6 2.4 2xLigation Mix 10 10 10 10 10 全量 20 20 20 20 20
- (6) TetR,K121013の蛍光強度測定
- 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
- ↓終濃度がlessおよび1nM~1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
- ↓37℃でインキュベート
- ※10分ごとに菌液500μLずつ回収した
- ↓cfg.4℃ 14,000rpm 1min
- ↓上清を除いた
- ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
- ↓全量を蛍光強度測定に用いた
- ※この操作を90分まで行った
Results
- (1)
表3: 吸光度結果 1/100 dps AcrAB ahpC 1回目 1.242 1.570 2.616 2回目 1.173 1.595 2.538 3回目 1.167 1.516 2.531 4回目 1.168 1.389 2.533 5回目 1.169 1.394 2.512 平均 1.1838 1.4928 2.546 濃度 5919(ng/µl) 7464(ng /µl) 12730(ng/µl)
- (2)次回に正しくcutされているのかを電気泳動で確認する
- (3)吸光度測定(260nm)の結果を表4に示した。
- 但し、試料8は1回測定した後、間違えて希釈した試料を捨ててしまった
- また、前日の実験(3)では7つの試料であったが、
- 切り出したゲルを10個のエッペンに分けて入れたので、今回は試料数が10になっている
表4: 吸光度(1/100) 試料1 試料2 試料3 試料4 試料5 試料6 試料7 試料8 試料9 試料10 1回目 0.024 0.017 0.009 0.054 0 0.059 0.081 0.006 0.016 0.015 2回目 0.017 0.021 0.011 0.056 0.003 0.067 0.086 0.013 0.007 3回目 0.017 0.013 0.012 0.054 0.006 0.06 0.078 0.015 0.012 4回目 0.017 0.018 0.013 0.061 0.004 0.061 0.078 0.015 0.009 5回目 0.018 0.014 0.014 0.06 0 0.063 0.083 0.019 0.008 平均 0.019 0.0166 0.0118 0.057 0.0026 0.062 0.0812 0.006 0.0156 0.0102 濃度(ng/μl) 93 83 59 285 13 310 406 30 78 51
- (4) acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodAを電気泳動したゲルを粉砕してしまったので、DNAのゲル抽出はできなかった
- sufA,yaiA,pSB1C3に関してはDNAのゲル抽出ができた
- 吸光度測定(260nm)の結果を表に示した
表5: 吸光度測定結果(1/100) SufA pSB1C3
(EcoRⅠとPstⅠでcut)yaiA 1回目 0.041 0.034 0.07 2回目 0.039 0.033 0.069 3回目 0.04 0.034 0.068 平均 0.04 0.0344 0.069 濃度(ng/μl) 200 172 345
- (5) 明日、コロニーができているかを確認する
- (6) 29日実験ノートに添付
Consideration
- (3) 100倍希釈で吸光度が0.010より小さい値を示した試料5と試料8はとても薄く、
- 誤差の範囲(ゼロ補正に使ったMilliQでも出うる値)なので、使い物にはならないと思われる
- (4) 低融点アガロースゲルは非常にもろく壊れやすいので、持ち運びに細心の注意が必要
September 28
Time
- 9:00~
Member
- 福山、古道、吉村
- Fukuyama,Furumichi,Yoshimura
Purpose
- (1) 前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック [古道]
- (2) sufAの制限酵素処理 [古道]
- (3) pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出 [福山]
- (4) pSB6A1(AcrAB,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(OxyR,GFP),pSB6A1(SodA,GFP),
- pSB6A1 (SufA,GFP),pSB6A1 (yaiA,GFP),pSB6A1 (dps,GFP)のEcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理 [福山]
- (5) DH5α: pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ [福山]
Method
- (1) 前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック
- 前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPを電気泳動した
- (2) sufAの制限酵素処理
- 12615(ng/μl)のsufAを以下の組成の通りに制限酵素処理をした
- ↓37℃、一晩、インキュベートした
表1: 制限酵素処理 DNA 10μl Buffer H 5μl H2O 8.5μl EcoRⅠ 1μl SpeⅠ 0.5μl total 25μl
- (3) pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出
- EcoRⅠとXbaⅠで制限酵素処理をしたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)がそれぞれ100 μg入っている
- 6つの試料に、CIAPを3 μlずつ加え、37℃で30分置いた
- ↓CIAP処理を終えたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)、
- EcoR1とSpe1で制限酵素処理をしたOxyRとAcrABを1%アガロースゲルを用いて、50Vで50分間電気泳動した
- ↓EtBrで20分間染色
- ↓UVを照射し、ゲルを切り出した(pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は2つのエッペンチューブにわけて回収した
- ↓MilliQをそれぞれ400 μl 加えた
- ↓60℃に7分ほど置いて、ゲルを溶かした
- ↓フェノールを、エッペンチューブに入っているゲルとMilliQの合計量ほど加え、かるく混ぜた
- ↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した
- ↓上清を回収し、フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、ボルテックス
- ↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した
- ↓上清を回収した
- ↓酢酸ナトリウムを50 μl、イソプロパノールを800 μl加え混ぜた
- ↓4℃, 14500 rpm で10分間遠心した
- ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
- ↓4℃, 14500 rpm で5分間遠心した
- ↓上清を捨てた
- ↓乾燥させた
- ↓pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は、エッペンチューブ1本あたり11 μlのTEに溶かした
- そのうちの1μlはMilliQで100倍希釈して、吸光度を測定したOxyRとAcrABはそれぞれ20 μlのTEに溶かした
- (4) EcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理
- 表2の通りにDNA溶液に制限酵素,バッファーとMilliQを加えて、
- それぞれ全量が25 μlになるようにした(DNAはそれぞれ約100 μgになっている)
- ↓overnightで37℃に置いた
表2:制限酵素試薬組成 単位はμl 試料1 試料2 試料3 試料4 試料5 試料6 試料7 AcrAB 9 ahpc 6 dps 9 OxyR 7 SodA 7 SufA 9 yaiA 6 EcoRⅠ 1 1 1 1 1 1 1 pstI 1 1 1 1 1 1 1 buffer H 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Milli Q 11.5 14.5 1.5 13.5 13.5 11.5 14.5 合計 25 25 25 25 25 25 25
- (5) DH5α: pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ
- 27日の実験(5)で行ったトランスフォーメーションの結果、
- DH5α: pSB1C3(OxyR)
- pSB1C3(SodA)
- のみコロニーが確認できたので、それぞれDH5α(pSB1C3(OxyR))は16個、
- DH5α(pSB1C3(SodA))は1個のコロニーをクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にストリークし、37℃に置いた
Results
- (1) それぞれ検出されたバンドの大きさは以下に記した通りになった
- dps → 約4kbp,約3kbp,約2kbp
- AcrAB → 約4kbp,約2kbp
- ahpC → 約2kbp,約1kbp
- (2) 結果は次回DNA抽出し吸光度を測定した際に見る
- (3) ゲル抽出済pSB6A1(プロモーターレス,RFP)の吸光度結果(100倍希釈)
表3: 吸光度測定結果 1/100 RFP(プロモーターレス)1 RFP(プロモーターレス)2 1回目 0.006 0.013 2回目 0.008 0.008 3回目 0.006 0.010 4回目 0.007 0.008 5回目 0.008 0.010 平均 0.007 0.0098 濃度 35(ng/μl) 49(ng/μl) - DNA濃度は十分になかった
- (4) 制限酵素を反応させるまでの作業であったので、特に結果として挙げられるものはなかった
- (5) ピックアップしたコロニーが、本当に正しくライゲーションできているのかわからない
- 少なくとも、明日確認した時、
- ストリークしたDH5αの部分が赤紫色になっているものは制限酵素処理の時点で失敗しているものである
Consideration
- (1) dps ,AcrABに関してはDNAの大きさが理想と異なる
- AcrABのDNAの長さは327bpと小さいものであるため今回の結果のような大きなDNAのバンドが検出されることはない
- 対しahpCは理想のDNAの大きさに近いものが検出されたためahpCは実験に使用可能のものといえる
- (3) DNA濃度が十分になかった理由としてはゲルの切り出しが甘かったためと思われる
September 29
Time
- 9:00~
Member
- 福山、臼井、中村、吉村
- Fukuyama,Usui,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)
- sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA(on K121013)のゲルからのDNA抽出 [福山、吉村]
- (2) TetR,K121013の蛍光強度測定 [臼井、中村]
- (3) DH5α(pSB1C3(OxyR)),DH5α(pSB1C3(SodA)) のLB液体培地への植菌 [福山]
- (4) ライゲーション、トランスフォーメーション [福山]
- ベクター:EcoRⅠとXbaⅠで切断したpSB6A1(プロモーターレス,RFP)
- インサート:EcoRⅠとSpeⅠで切断したOxyRとAcrAB
Method
- (1) ゲルからのDNA抽出
- 平常通りゲル抽出をおこなったが、今回は低融点ゲルを用いず普通のアガロースゲルを用いてゲルの切り出しをした
- ↓ゲルの重さを測り、ゲルの3倍量のBufferQGを入れた
- ↓5分間50℃でヒートショック
- ↓ゲルと等量のイソプロパノールを加え、カラムにアプライした
- ↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
- ↓500μlのBufferQGを加えた
- ↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
- ↓750μlのBufferPEを加えた
- ↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
- ↓もう一度10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
- ↓カラムをエッペンに移し替え30μlのミリQを滴下した
- ↓10,000rpm,4℃で1分間遠心した
- (2) TetR,K121013の蛍光強度測定
- 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
- ↓終濃度がlessおよび1nM~1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
- ↓37℃でインキュベート
- ※10分ごとに菌液500μLずつ回収した
- ↓cfg.4℃,14000rpm,1min
- ↓上清を除いた
- ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
- ↓全量を蛍光強度測定に用いた
- ※この操作を90分まで行った
- (3) DH5α(pSB1C3(OxyR)),DH5α(pSB1C3(SodA)) のLB液体培地への植菌
- 28日にクロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
- DH5α(pSB1C3(OxyR))とDH5α(pSB1C3(SodA))をクロラムフェミコールが入った3 mlのLB液体培地3セット分それぞれ植菌した
- (4) ライゲーション、トランスフォーメーション
- 表1の通りに試料1、試料2をつくった
- pSB6A1(プロモーターレス,RFP) → 17.6 ng/μl
- AcrAB → 61 ng/μl
- OxyR → 39 ng/μl
- ↓16℃に30分間置いた
- ↓氷上に30分間置いた
- ↓DH5αの懸濁液を100 μlずつ加えた
- ↓氷上に30分間置いた
- ↓42℃に45秒置いた
- ↓氷上に2分間置いた
- ↓SOC培地を900 μlずつ加えた
- ↓37℃で1時間振とう培養した
- ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた
表1: 試薬組成(単位はμl) 試料1 試料2 pSB6A1(プロモーターレス,RFP) 9 7.8 AcrAB 1 OxyR 1.5 Milli Q 0.7 2xLigation Mix 10 10 合計 20 20
Results
- (1) sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR(on K121013)はバンドが見えなかった
- sodA(on K121013)は予想された位置とは違う場所にバンドが出た
- acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)は切り出しに成功した
- acrAB,oxyR,sufAの濃度は以下の通り
- *acrAB……39ng/μl(全量28μl)
- *oxyR……61ng/μl(全量28μl)
- *sufA……54.5ng/μl(全量58μl)
- (2) ちょっと通りますよ。
- (3) 今日は、培養できたかどうかまだ判断できなかった
- (4) 成功していれば、明日コロニーが観察できると思われる
Consideration
- (1) バンドが見えなかったのはRNAが分解されていなかったためと思われる
- これからはRNaseを入れた後に37℃のインキュベーターの中に30分間入れておくという操作が必要である
- バンドが予想された位置に出なかった理由は不明
September 30
Time
- 9:00~
Member
- 岩城、竹内、中村
- Iwaki,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) ahpC,sufAのPCR [岩城]
- (2) ahpC,sufAの制限酵素処理 [岩城]
- (3) ミニプレ後のRFP(promoterless , on psB6A1)のカットチェック [竹内]
- (4) pSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)のミニプレップ [岩城]
- (5) oxyR、sodA(on pSB1C3)のミニプレ [中村]
Method
- (1) ahpC,sufAのPCR
- 500μLエッペンに下表1の組成で溶液を加えた
- ahpC 2本、sufA 4本を調整した
- 下表2のプログラムでPCR反応を行った
表1: 試薬組成 PM 0.75μl 鋳型DNA(DH5α 3) 0.25μl 10xPCR Buffer for KOD-Plus 2.5μl 2mM dNTPs 2.5μl 2mM MgSO4 2.0μl Milli Q 16.5μl KOD-Plus- 0.5μl 全量 25μL 表2: PCRプログラム 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ (60.2)℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min ∞ 30サイクル
- 各サンプルから5μlとってローディングダイ1μlと混合して1%ゲルを用いて
- 1kb Makerとともに100V、25minの条件で電気泳動した
- ↓EtBrで30min染色した。
- ↓UVを照射し、写真を撮影した
- ↓サンプルをまとめた
- sufA(total 60μl)、ahpC(total 40μl)から1μlとって100倍希釈して吸光度を測定した
- (2) ahpC,sufAの制限酵素処理
- ahpC,sufAの制限酵素処理
- (1)で増やしたahpC,sufAを制限酵素処理した
- 組成は下表3の通り
- これらを37℃で1hインキュベートした
表3: 制限酵素処理試薬組成 ahpC(total 50 μl) DNAsol 39 μl EcoRⅠ 1 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 5 μl H2O 4.5 μl sufA(total 50 μl) DNAsol 29.5 μl EcoRⅠ 1 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 5 μl H2O 14 μl sufAC(total 50 μl) DNAsol 29.5 μl EcoRⅠ 1 μl PstⅠ 1 μl H buffer 5 μl H2O 13.5 μl
- (3) ミニプレ後のRFP(promoterless , on psB6A1)のカットチェック
- EcoRⅠ,XbaⅠで制限酵素処理した試料とミニプレ後の試料から各5μlとって
- ローディングダイ1μlと混合して1%ゲルを用いて1kb Makerとともに135v,20minの条件で電気泳動した
- ↓EtBrで20min染色した
- ↓UVを照射し、写真を撮影した
- ↓各バンドを比較した
- (4) pSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)のミニプレップ
- 朝、植菌したpSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)を遠心1分(25℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓室温5min
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓on ice 5min
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓on ice 5min
- ↓遠心5分(25℃、14,500rpm)
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓ΦOH/CIAAを200μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000rpm)
- ↓水層を新しいチューブに移した
- ↓100%EtOHを1ml加えた
- ↓室温で10min
- ↓遠心12min(15,000rpm,4℃)
- ↓上清を捨てた
- ↓70%EtOHを加えた
- ↓遠心3min(15,000rpm,4℃)
- ↓上清を捨てた
- ↓乾燥2min
- ↓TE(RNase入り)を30μl加えた
- ↓37℃で30minインキュベートした
- ↓サンプルをまとめた
- ↓サンプルを1μlとり、TEで100倍希釈して吸光度を計測した
- (5) oxyR、sodA(on pSB1C3)のアルカリミニプレップ
- *手順は(4)と同様
- 最終的に、oxyR(1xTE30μL)、sodA(1xTE30μL)、sodA(TE、RNase入30μL)の3種類を得た
- →RNaseを十分に働かせるため37℃で30minインキュベートした
- 内、1μLを吸光度測定に用いた
Results
- (1) 電気泳動の結果、sufAの2番のサンプルはバンドが検出できなかったので破棄した
- 残りのサンプルをまとめて計測した吸光度は以下であった
表4: 吸光度測定結果 ahpC 0.044 0.051 0.057 0.058 0.053 平均 0.0526 濃度 0.0526×100×50=263 ng/μl sufA 0.060 0.061 0.057 0.061 0.061 平均 0.06 濃度 0.06×100×50=300 ng/μl
- (2) 後日ゲル抽出を行い、ライゲーションに使用、その結果を参照
- (3) ミニプレ後の試料に関しては十分に濃いバンドを確認できたが、
- 制限酵素処理した試料に関してはバンドを確認することができなかった
- (4)
表5: 吸光度測定結果 pSB6A1(K362008) 2.643 2.582 2.578 2.561 2.568 平均 2.5864 濃度 12932 ng/μl pSB6A1(K362012) 2.560 2.472 2.411 2.407 2.411 平均 2.4522 濃度 12261 ng/μl
- (5)
表6: 吸光度測定結果 oxyR on pSB1C3
(x1/300)0.858 0.905 0.908 0.918 0.917 平均 0.9012 濃度 13500 ng/μl
(未RNase処理)sodA on pSB1C3
(1xTE)0.953 0.988 1.066 1.012 1.026 平均 1.009 濃度 15135ng/μl
(未RNase処理)sodA on pSB1C3
(TE RNase入)0.693 0.684 0.689 0.694 0.691 平均 0.6902 濃度 10353ng/μl
(RNase処理済)- →これらを各1μLのEcoRⅠとPstⅠでカットした
Consideration
- (1) sufAの2番を除いてPCRは成功している、濃度も十分である
- (3)制限酵素処理した試料を36時間以上、37℃インキュベーター内に入れておいたことが、
- DNA消失の原因である可能性が高いと考えられる
- 今後、制限酵素処理が終わった試料はすみやかに冷凍庫へ入れるべきである。
- (5) カットチェックが完了していないので、断言はできないが、
- RNaseの有無における吸光度の差異からTE RNaseの酵素活性は十分であると考えられる
October 1
Time
- 22:00~23:00
Member
- 岩城、竹内、臼井
- Iwaki,Takeuchi,Usui
Puropose
- (1) pSB1C3(ahpC promoter only)のシーケンスを読む [岩城]
- (2) 提出用ベクターにLigation するためのK362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1の制限酵素処理 [竹内]
Method
- (1) pSB1C3(ahpC promoter only)のシーケンスを読む
- ・シークエンス用のプライマーの調整をした
- 注文したプライマーを150 μlのTEに溶かした
- ↓これを1 μMにするためにMilli Qで100倍希釈した
- ・次にPCRのための試薬調整をした
- 組成は以下の表のとおりとした
- pSB1C3(ahpC)のプラスミド抽出済み濃度は12730 ng/μlであった
- ↓Milli Qで100倍希釈した
- これを1 μl使用したので、DNA量は127.3 ng
- ↓Milli Qの量は全量が10 μlになるように調整した
- ↓プライマーFとRの2つのチューブを作成した
- ↓以下の条件でPCRをかけた
表1: composition Milli Q 4.4 μl Premix 2 µl 5 sequence buffer 1 µl Primer(1µM) 1.6 µl Plasmid DNA 1 µl Total 10 µl 表2: condition Cysles Temperature(℃) Time(min) Step1 1 96 1:00 Step2 30 96 0:10 50 0:05 60 4:00 Step3 1 4 ∞
- (2) 提出用ベクターにLigation するためのK362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1の制限酵素処理
- K362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1のミニプレ後の試料に制限酵素処理した
- 組成は以下の通り
- これらを37℃で8hインキュベートした
表3: 制限酵素処理試薬組成 K362008 ahpC GFP on psB6A1
(total 50 μl)DNAsol 10 μl EcoRⅠ 1 μl PstⅠ 1 μl H buffer 5 μl H2O 33 μl K362012 sufA GFP on psB6A1
(total 50μl)DNAsol 10 μl EcoRⅠ 1 μl PstⅠ 1 μl H buffer 5 μl H2O 33 μl
Results
- (1) PCRが終わったものを冷凍保存した
- (2) 10/2のゲル抽での電気泳動写真よりK362012 sufA GFP on psB6A1に関しては十分な制限酵素処理ができたと考えられるが、
- K362012 sufA GFP on psB6Aに関してはバンドが非常に薄かったため、制限酵素処理が十分でなかった可能性がある
Consideration
- (1) 10/3にシーケンスの読み取りの続きを行う
- (2) 酵素を入れた後の十分なピペッテイングがされていなかった
- 酵素処理の時間が短かった可能性が考えられる
October 2
Time
- 6:00~8:40
Member
- 岩城、竹内、臼井
- Iwaki,Takeuchi,Usui
Purpose
- (1) 9月30日に保存されたsufA(promoter only)の濃度測定 [臼井]
- (2) sufA,ahpC(ともにE-P処理後)の電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出 [臼井]
Method
- (1) 9月30日に保存されたsufA(promoter only)の濃度測定
- 100倍希釈して吸光度の測定(五回の平均より求めた)
- (2) sufA,ahpC(ともにE-P処理後)の電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出
- 全量の6倍希釈になるようにLoadong Bufferをそれぞれ加えた
- ↓1kbpマーカーとともに100V、30minで電気泳動
- ↓ゲルの切り出し
- ↓切りだしたゲルの重さを量った
- ↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート。2,3分毎に振り混ぜた
- ↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓内5μLを濃度測定に使用した
- (H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
Results
- (1)sufA(promoter only)の吸光度と濃度を以下に纏めた
表1: 吸光度測定結果 一回目 0.031 二回目 0.034 三回目 0.044 四回目 0.020 五回目 0.019 Ave 0.0296 濃度 148ng/μL
- (2)
表2: ゲル抽出後の吸光度と濃度 ahpC(E-P処理後) 一回目 0.019 二回目 0.021 三回目 0.022 四回目 0.018 五回目 0.018 Ave 0.0196 濃度 19.6ng/μL sufA(E-P処理後) 一回目 0.009 二回目 0.011 三回目 0.015 四回目 0.015 五回目 0.010 Ave 0.012 濃度 12ng/μL
Consideration
- (2) カラム使用のゲル抽出のため濃度が薄くなってしまっている
- 電気泳動の際、ahpCに関してなぜかバンドが3本存在した。なぜかは不明
- またRNase in TEに溶かしているにもかかわらず、写真にRNAが写っていた→RNase失活の疑い