Template:KIT-Kyoto-September3

== September 3 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
'''Time'''
:9:00～

'''Member'''
:福山,足立,吉村
:Fukuyama,Adachi,Yoshimura

'''Purpose'''
# DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
# pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Adachi]
# Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Fukuyama]

:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]
:(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]
:(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),
::pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動　[福山]

'''Method'''
:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理 
<TABLE BORDER="0"><TR><TD ROWSPAN="2">
::　前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした
::　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌）
::　↓上清を捨てた
::　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした
::　↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解)
::　↓1分間放置した
::　↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出)
::　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した
::　↓上清をカラムに流した
::　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した
::　↓溶出液を捨てた
::　↓SolutionⅣを500μl加えた
::　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
::　↓溶出液を捨てた
::　↓SolutionⅤを700μl加えた
::　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
::　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
::　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
::　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)
::　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した
::　↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った
::　　(値を右表1に示した)
::　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った
::　↓37℃で40分間インキュベートした
::　↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった
::</TD>
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD COLSPAN="2">表1: 吸光度</TD></TR>
::<TR>
::<TD COLSPAN="2">×1/100 pSB6A1</TD></TR>
::<TR>
::<TD>1回目</TD><TD>0.041</TD></TR>
::<TR>
::<TD>2回目</TD><TD>0.047</TD></TR>
::<TR>
::<TD>3回目</TD><TD>0.047</TD></TR>
::<TR>
::<TD>4回目</TD><TD>0.050</TD></TR>
::<TR>
::<TD>5回目</TD><TD>0.045</TD></TR>
::<TR>
::<TD>Ave.</TD><TD>0.046</TD></TR>
::</TABLE></TD></TR>
::<TR>
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD COLSPAN="2">表2: 試薬組成</TD></TR>
::<TR>
::<TD>DNA</TD><TD>10μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>M Buffer</TD><TD>6μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>Milli Q</TD><TD>7.4μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>Total</TD><TD>20μl</TD></TR>
::</TABLE>
::</TD></TR></TABLE>

:(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理
<TABLE BORDER="0"><TR><TD VALIGN="top">
::　pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD<SUB>260</SUB>で濁度を測定した
::　濁度の測定結果を右表3に示す
::　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度
::　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×10<SUP>2</SUP>(μg/ml)と分かった
::　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした
<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD COLSPAN="2">表3: 濁度</TD></TR>
::<TR>
::<TD COLSPAN="2">×1/100 pSB6A1</TD></TR> 
::<TR>
::<TD>1回目</TD><TD>0.007</TD></TR>
::<TR>
::<TD>2回目</TD><TD>0.015</TD></TR>
::<TR>
::<TD>3回目</TD><TD>0.008</TD></TR>
::<TR>
::<TD>4回目</TD><TD>0.012</TD></TR>
::<TR>
::<TD>5回目</TD><TD>0.012</TD></TR>
::<TR>
::<TD>Ave.</TD><TD>0.0108</TD></TR>
::</TABLE>
::</TD></TR></TABLE>

:(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動
::　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を
::　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた
::　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

'''Results'''
:(1)　バンドが出なかった
:(2)　pSB6A1(K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった
:(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
::pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
::pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
::pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった


'''Consideration'''
:(1)　試薬に問題ありか？
:(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる