Template:KIT-Kyoto-September2

== September 2 ==

'''Time'''
:9:00～

'''Member'''
:岩城,福山,古道,足立

'''Purpose''' 
:(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理
:(2)　プロモーターDNAのみを得る
:(3)　プロモーターDNAを精製する
:(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)
::pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする

'''Method'''
:(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理
::　pSB6A1(K121013)の2試料(試料A,B)のうち、
::　試料Aの一部を右表1,2の通りに制限酵素処理して135Vで15分間電気泳動した
::　↓試料A,Bに酢酸ナトリウム200μL、イソプロパノール400μL(等量)を加えた 
::　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した 
::　↓70%EtOHを200μL加えた 
::　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した 
::　↓遠心乾燥を行った 
::　↓これにMilliQ30μLを加えた
::　↓表3の通りに各試薬を加えて37℃で3時間ほどインキュベートした
::　　　　※試料Bはここまで(一晩インキュベート)
::　↓CIAPを3μl加えて37℃で30分間インキュベートした　 
::　↓3-colors Indicatorを8μl加え、50Vで１時間電気泳動した 
::<TABLE BORDER="0"><TR>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD>表1</TD></TR>
::<TR>
::<TD>DNA</TD><TD>10μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>Buffer H</TD><TD>2μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>MilliQ</TD><TD>7.4μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>total</TD><TD>20μl</TD></TR>
::</TABLE></TD>
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD>表2</TD></TR>
::<TR>
::<TD>DNA</TD><TD>10μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>MilliQ</TD><TD>10μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>total</TD><TD>20μl</TD></TR>
::</TABLE></TD>
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD>表3</TD></TR>
::<TR>
::<TD>DNA溶液</TD><TD>30μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>0.5μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>0.5μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>H Buffer</TD><TD>4μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>MilliQ</TD><TD>5μl</TD></TR>
::<TR>
::<TD>total</TD><TD>40μl</TD></TR>
::</TABLE>
::</TD></TR></TABLE>

:(2)　プロモーター(hemH,AcrAB,yaiA,SodA)のゲル抽出
::　Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした 
::　↓1kbpマーカーとともに50Vで1時間電気泳動した 
::　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた 
::　↓ゲルの3倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベートし、2,3分毎に振り混ぜた
::　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを370μL加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓溶出液を新しいエッペンチューブにうつした　　　

:(3)　プロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)のフェノクロ処理
::＜材料＞
::　PCR済みのプロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)
::　H2O
::　フェノールクロロホルム
::　2-プロパノール
::　70%ethanol

::＜方法＞
::　PCR後のDNAを以下の量エッペンに取り、全量600μlになるようH2Oを加え調節した
::　hemH,OxyRについては、前回DNA量200μlでGEL抽出を行なおうとした際バンドが薄く抽出できなかったため、
::　他のプロモーターのDNA量よりも増やした
::<TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD></TD><TD>dps</TD><TD>SodA</TD><TD>yaiA</TD><TD>AcrAB</TD><TD>hemH</TD><TD>OxyR</TD></TR> 
::<TR>
::<TD>DNA(μl)</TD><TD>200</TD><TD>200</TD><TD>200</TD><TD>200</TD><TD>400</TD><TD>400</TD></TR>
::<TR>
::<TD>H<SUB>2</SUB>O(μl)</TD><TD>400</TD><TD>400</TD><TD>400</TD><TD>400</TD><TD>200</TD><TD>200</TD></TR>
::<TR>
::<TD>計(μl)</TD><TD COLSPAN="6">600</TD></TR>
::</TABLE>
::
::　↓CH3COONa 50μlを各エッペンに加えた。
::　↓フェノールクロロホルムをエッペンの8割ぐらいまで入れた
::　↓2，3回振ったのち、白濁するまでvoltexをした
::　↓cfg,14500rpm,5min,Tr(室温)
::　↓上清を回収したのち、2-プロパノールをエッペンの8割ぐらいまで加えた
::　↓cfg,14500rpm,10min,4℃
::　↓上清を捨て、70%ethanolをエッペンの8割ぐらいまで加えた
::　↓cfg,14500rpm,3min,4℃
::　↓上清を捨てた
::　↓遠心乾燥機でペレットが乾燥するまで待った
::　↓RNase in TE(10mg/ml)を各エッペンに30μlずつ加えた

:(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)、
::pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出
::　一晩制限酵素処理したpSB6A1(K121013)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした 
::　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1(K121013)とpSB1A2(E0420)、
::　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)を1％青ゲルに流し135Vで15分間電気泳動した
::　↓バンドが検出されゲルの切り出しができそうなpSB1A2(E0420) 
::　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のゲルを切り出した
::　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った
::　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
::　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
::　↓cfg.10,000rpm-1min
::　↓保存した

'''Results'''
:(1)　カットチェックは問題なかったが、ゲル抽出のための電気泳動後、
::2本みえるはずのバンドが何故か4本確認できた。おかしな結果がでた試料Aは廃棄することにした
:(2)　本当は最後は37μlのMilliQを加えるはずが、誤って370μl加えてしまった
::今日は吸光度を計測しなかったので、濃度はまだ分かっていない
:(3)　各プロモーターDNAを精製することができた
:(4)　電気泳動の結果、pSB6A1(K121013)にはバンドが現れずまたは薄すぎて見えなかったのか、
::ゲル抽出をすることができなかった。そのためpSB6A1(K121013)の濃縮を行う必要があった
::その濃縮を実験内容(1)で行った