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Contents

October 3

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Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション [福山、革島]
(2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き) [岩城]
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養 [吉村]
(4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR [革島、吉村]

Method

(1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
*ライゲーション
 pSB1C3 + SufA
     + SufA+GFP
    + AhpC+GFP    をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
 ↓16℃30min
*トランスフォーメーション
 コンピテントセル100μLずつ加えた
 ↓氷上30min
 ↓42℃45min
 ↓氷上2min
 ↓SOC培地900μL加えた
 ↓1h振とう培養
 ↓ストリーク
(2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
 10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
 0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
 ↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
 ↓氷冷 15min.
 ↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
 ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
 ↓上清を捨てた
 ↓70 % EtOHを50 µlを加えた
 ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
 ↓Remove sup.
 ↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
 ↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
 ↓95 ℃,2 min加熱した
 ↓氷冷(急冷)
 ↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
 ↓シークエンス用のゴムのふたをした
 ↓シークエンサーにいれた
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
 ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
(4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
 以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
*ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)0.75ul
テンプレートDNA0.5ul
MgSO42ul
dNTPs2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
Milli Q16.25ul
Total25ul
表2: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃61℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min
35サイクル
*PCR産物の確認
 各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
 ↓1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー3μLを添加した
 ↓135v,20minで電気泳動
 ↓20minEtBr染色
 ↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1) 翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
(2) 明日、シークエンスを確認
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
(4) 吸光度を測定し濃度を計算した結果、
ahpC…1482ng/μl
  2…360ng/μl
sufA1…265ng/μl
  2…425ng/μl
oxyR1…367ng/μl
  2…369ng/μl
sodA1…427ng/μl
  2…340ng/μl
yaiA1…267ng/μl
  2…481ng/μl
acrAB1…368ng/μl
  2…557ng/μl
dps1…530ng/μl
  2…440ng/μl
だった(全量は全て19μl)
*電気泳動
 全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

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Time

19:00~22:30

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) 10月3日の実験(3)の結果の確認 [福山]
(2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理 [福山]
(3) SufA,ahpC,の制限酵素処理 [福山]
(4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック [福山]

Method

(1) 10月3日の実験(3)の結果の確認
 クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した
(2) pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理
 25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μl加えた
 ↓SolutionⅢを350μl加えた
 ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
 ↓上清をカラムに入れた
 ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 ↓抽出液を捨てた
 ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 ↓抽出液を捨てた
 ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
 ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 ↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった
 ↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)
  また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)
 ↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた
 ↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した
 ↓上清を回収した
 ↓70 %エタノールを800 μl加えた
 ↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
 ↓上清を除いた
 ↓乾燥した
 ↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)
 ↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした
 ↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った
表1: 制限酵素処理1
単位はμl試料1試料2試料3試料4
DNA溶液12.5131313
Buffer H1.51.51.5
EcoRⅠ0.50.5
Pst0.50.5
全量15151513
表2: 制限酵素処理2
試料(μl)
DNA溶液29
Buffer H4
EcoRⅠ1
Pst1
Milli Q5
全量40
(3) SufA,ahpC,の制限酵素処理
 表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った
表3: sufA(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
Spe0.5 μl
M buffer2.5μl
H2O1.5 μl
表4: ahpC(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
Spe0.5 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5 μl
(4) 提出用ベクターpsB1C3のカットチェック
 ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した
 そして、制限酵素処理した2つの試料と
 制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した
 ↓135V ,20分で電気泳動
 ↓EtBr で20分間染色
  バンドを確認した
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ1 μl
Spe1 μl
M buffer2.5 μl
H2O0.5μl
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
Spe1 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5μl

Results

(1) DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。
あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった
(2) (*1)の結果:20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度:170 ng/μl
(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。
(*3)の結果から求めた濃度:1148 ng/μl ← 6.8倍濃縮
(3) 明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、
フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う
(4) EcoRⅠ, SpeⅠで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した
他の2試料は予想通りであった

Consideration

(4) クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる
次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである

October 5

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Time

9:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション [福山]
   ベクター : pSB1C3(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
   インサート: ahpC,SufA(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
(2) pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ [竹内]

Method

(1) ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション
 青ゲルを使って、前日に制限酵素処理をしたpSB1C3,ahpC,SufAをそれぞれ電気泳動した
 ↓バンドを切り取った(pSB1C3は観察された2本のバンドのうち、サイズが大きい方を切り取った)
 ↓切り取ったahpC,SufAを別々のエッペンドルフチューブに入れ、pSB1Cは2分割してそれぞれ
 ahpC,SufAが入ったエッペンに入れた
  (以下はこの2つの試料のうち、1試料分の実験手順を書いた)
 ↓フェノールを等量加え、ボルテックス
 ↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 ↓上清を回収した
 ↓フェノールクロロフォルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
 ↓5分間遠心した(25℃, 13000 rpm)
 ↓上清を回収した
 ↓酢酸ナトリウムを50 μl,イソプロパノールを800 μl加えた
 ↓10分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 ↓上清を捨てた
 ↓70%エタノールを500 μl加えた
 ↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 ↓上清を捨てた
 ↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
 ↓16℃に30分間置いた
 ↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
 ↓氷上に30分間置いた
 ↓42℃に30分間置いた
 ↓氷上に2分間置いた
 ↓soc培地を900 μl加えた
 ↓37℃で1時間振とう培養した
 ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
 ↓37℃で一晩インキュベートした
(2) pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ
 前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
 遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え
 ↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
 ↓カラムにMilli Qを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilli Qに溶かした
 このうち1 μlずつとってMilli Qで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した

Results

(1) 特に結果として示せるものはなかった
トランスフォーメーションができていれば明日コロニーが観察されると思われる
(2) 得られた7試料の濃度に関して、
ahpCの2試料はそれぞれ266ng/μl,390ng/μl,
sufAの5試料はそれぞれ303ng/μl,223ng/μl,223ng/μl,140ng/μl,302ng/μlであった
これより、十分な濃度の試料が得られた

October 6

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Time

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) DH5α(pSB1C3(sufA)), DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ [福山]
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]

Method

(1) DH5α(pSB1C3(sufA)), DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
 ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
 ↓遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 Premix 2 μl
 5xsequence buffer 1 μl
 Primer(1 μM) 1.6 μl
 プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min
30サイクル
エタノール沈殿
 ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
 ↓氷上で15分間冷やした
 ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓乾燥させた(よく乾かした)
 ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 ↓95 ℃で2分加熱した
 ↓氷上で冷やした(急冷)
 ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 ↓シークエンス用の蓋をした
 ↓シークエンサーに入れた

Results

(1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
(2) 十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
(2) コンタミの可能性が考えられる

October 7

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Time

18:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ [福山]
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]

Method 【実験方法】

(1) DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
 前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
 遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
 ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした
  このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した


(2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 H2O 全量10 μlになるように調整した
 Premix 2 μl
 5xsequence buffer 1 μl
 Primer(1 μM) 1.6 μl
 プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min
30サイクル
エタノール沈殿
 ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
 ↓氷上で15分間冷やした
 ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓乾燥させた(よく乾かした)
 ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 ↓95 ℃で2分加熱した
 ↓氷上で冷やした(急冷)
 ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 ↓シークエンス用の蓋をした
 ↓シークエンサーに入れた

Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す

表2: 吸光度測定結果
ahpC-1ahpC-2sufA-1sufA-2
0.0660.1181.0050.022
0.0530.1140.6810.023
0.0550.1110.4920.024
0.0480.1060.4480.016
0.0470.1030.3280.015
0.276
平均0.05380.11040.53830.02
希釈前の濃度
(ng/μl)
2695522692100
(2) 後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった

Consideration

(2) RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき

October 8

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Time

10:30~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ [福山]
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]

Method

(1) pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ
 前日から培養していたpSB6A1(ahpC,GFP)を
 遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 ↓溶出液を4℃で保存した


(2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 Premix 2 μl
 5xsequence buffer 1 μl
 Primer(1 μM) 1.6 μl
 プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min
30サイクル
エタノール沈殿
 ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
 ↓氷上で15分間冷やした
 ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓乾燥させた(よく乾かした)
 ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 ↓95 ℃で2分加熱した
 ↓氷上で冷やした(急冷)
 ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 ↓シークエンス用の蓋をした
 ↓シークエンサーに入れた

Results

(1) 濃度測定をしなかったので、特に結果として残すものはなかった
(2) 試料ahpC-1に関しては正しい塩基配列を読むことができた

Consideration

(2) ahpC-1以外の試料の正確な塩基配列が読めなかった理由としてDNA濃度が不十分であった可能性がある

October 9

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