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Template:KIT-Kyoto-week9
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Revision as of 09:16, 24 October 2010 by Matsubara3 (Talk | contribs)
Contents |
October 3
Time
- 11:00~18:30
Member
- 岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
- Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura
Purpose
- (1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション [福山、革島]
- (2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き) [岩城]
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養 [吉村]
- (4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR [革島、吉村]
Method
- (1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
- ＊ライゲーション
- pSB1C3 + SufA
- + SufA+GFP
- + AhpC+GFP をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
- ↓16℃30min
- ＊トランスフォーメーション
- コンピテントセル100μLずつ加えた
- ↓氷上30min
- ↓42℃45min
- ↓氷上2min
- ↓SOC培地900μL加えた
- ↓1h振とう培養
- ↓ストリーク
- (2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
- 10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
- 0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
- ↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
- ↓氷冷 15min.
- ↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
- ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
- ↓上清を捨てた
- ↓70 % EtOHを50 µlを加えた
- ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
- ↓Remove sup.
- ↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
- ↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
- ↓95 ℃,2 min加熱した
- ↓氷冷(急冷)
- ↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
- ↓シークエンス用のゴムのふたをした
- ↓シークエンサーにいれた
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
- ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
- (4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
- 以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
＊ahpC,sufA,oxyR,sodA プライマー(PM) 0.75ul テンプレートDNA 0.5ul MgSO4 2ul dNTPs 2.5ul KODplus 0.5ul Buffer 2.5ul Milli Q 16.25ul Total 25ul 表2: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 61℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min ∞ 35サイクル
- ＊PCR産物の確認
- 各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
- ↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
- ↓135v,20minで電気泳動
- ↓20minEtBr染色
- ↓UV照射下でバンドの確認
Results
- (1) 翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
- (2) 明日、シークエンスを確認
- (3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
- (4) 吸光度を測定し濃度を計算した結果、
- ahpC…1482ng/μl
- 2…360ng/μl
- sufA1…265ng/μl
- 2…425ng/μl
- oxyR1…367ng/μl
- 2…369ng/μl
- sodA1…427ng/μl
- 2…340ng/μl
- yaiA1…267ng/μl
- 2…481ng/μl
- acrAB1…368ng/μl
- 2…557ng/μl
- dps1…530ng/μl
- 2…440ng/μl
- だった(全量は全て19μl)
- ＊電気泳動
- 全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた
October 4
October 5
October 6
Time
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- (1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ [福山]
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]
Method
- (1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
- 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
- ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
- ↓遠心１分（25℃、14,500 rpm）して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
- ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分（25℃、14,500 rpm）
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
- ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
- ↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分（4℃、15,000 rpm）(*1)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分（4℃、15,000 rpm）
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
- (2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
- Premix 2 μl
- 5xsequence buffer 1 μl
- Primer(1 μM) 1.6 μl
- プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
- 総量 10 μl
表1: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 96℃ 96℃ 50℃ 60℃ 4℃ 1min 10sec 5sec 4min ∞ 30サイクル
- エタノール沈殿
- ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
- ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
- ↓氷上で15分間冷やした
- ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
- ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
- ↓乾燥させた(よく乾かした)
- ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
- ↓95 ℃で2分加熱した
- ↓氷上で冷やした(急冷)
- ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
- ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
- ↓シークエンス用の蓋をした
- ↓シークエンサーに入れた
Results
- (1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
- DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
- その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
- (2) 十分に正確な塩基配列を読むことができなかった
Consideration
- (1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
- (今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
- DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
- (2) コンタミの可能性が考えられる
