Template:KIT-Kyoto-week9

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(→October 3)
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'''Purpose'''
'''Purpose'''
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# Ligation of pSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP and transform those into the competent cells.[Fukuyama,Kawashima]
 +
# Analysis of sequence of pSB1C3(ahpC).[Iwaki]
 +
# Cultivate of ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3.[Yoshimura]
 +
# PCR of ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dps.[Kawashima,Yoshimura]
:(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]
:(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]
:(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]
:(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]
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== October 4 ==
== October 4 ==
-
 
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
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'''Time'''
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:19：00~22:30
-
== October 5 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内
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:Fukuyama,Takeuchi
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'''Purpose'''
 +
# Confirmation of result on which experiment (3) on October 3.[Fukuyama]
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# DNA miniprep of pSB1C3(BBa_J04450) and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
 +
# Digestion of sufA and ahpC by restriction enzymes.[Fukuyama]
 +
# Digestion of pSB1C3 by restriction enzymes and agarose gel electrophoresis.[Fukuyama]
 +
:(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認　[福山]
 +
:(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理　[福山]
 +
:(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理　[福山]
 +
:(4)　提出用ベクターpSB1C3のカットチェック　[福山]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認
 +
::　クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した
 +
 +
:(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理
 +
::　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった
 +
::　↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)
 +
::　　また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)
 +
::　↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた
 +
::　↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した
 +
::　↓上清を回収した
 +
::　↓70 %エタノールを800 μl加えた
 +
::　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
 +
::　↓上清を除いた
 +
::　↓乾燥した
 +
::　↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)
 +
::　↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした
 +
::　↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="5">表1: 制限酵素処理1</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>単位はμl</TD><TD>試料1</TD><TD>試料2</TD><TD>試料3</TD><TD>試料4</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA溶液</TD><TD>12.5</TD><TD>13</TD><TD>13</TD><TD>13</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer H</TD><TD>1.5</TD><TD>1.5</TD><TD>1.5</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>0.5</TD><TD>0.5</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>0.5</TD><TD></TD><TD>0.5</TD><TD></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>全量</TD><TD>15</TD><TD>15</TD><TD>15</TD><TD>13</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表2: 制限酵素処理2</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>試料(μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA溶液</TD><TD>29</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer H</TD><TD>4</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>1</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>5</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>全量</TD><TD>40</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理
 +
::　表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表3: sufA(total 25 μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>20 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>0.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>0.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M buffer</TD><TD>2.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>1.5 μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表4: ahpC(total 25 μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>20 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>0.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>0.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M buffer</TD><TD>2.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>1.5 μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック
 +
::　ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した
 +
::　そして、制限酵素処理した2つの試料と
 +
::　制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した
 +
::　↓135V ,20分で電気泳動
 +
::　↓EtBr で20分間染色
 +
::　　バンドを確認した
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">pSB1C3(total 25 μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>20 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Eco''RⅠ</TD><TD>1 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>1 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M buffer</TD><TD>2.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>0.5μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">pSB1C3(total 25 μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>20 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>1 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M buffer</TD><TD>2.5 μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。
 +
::あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった
 +
:(2)  (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl
 +
::(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。
 +
::(*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl　← 6.8倍濃縮
 +
:(3)　明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、
 +
::フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う
 +
:(4)　''Eco''RⅠ, ''Spe''Ⅰで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した
 +
::他の2試料は予想通りであった
 +
 
 +
'''Consideration'''
 +
:(4)　クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる
 +
::次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである
 +
 +
== October 5 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9:00~
-
== October 6 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内
 +
:Fukuyama,Takeuchi
 +
'''Purpose'''
 +
# Isolation of pSB1C3,ahpC and SufA from agarose gel and ligation and transformation.[Fukuyama]
 +
# DNA miniprep of pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)[Takeuchi]
 +
:(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション　[福山]
 +
::　　　ベクター　： pSB1C3(''Eco''RⅠ,''Pst''Ⅰでカット済み)
 +
::　　　インサート： ahpC,SufA(''Eco''RⅠ,''Pst''Ⅰでカット済み)
 +
:(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ　[竹内]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション
 +
::　青ゲルを使って、前日に制限酵素処理をしたpSB1C3,ahpC,SufAをそれぞれ電気泳動した
 +
::　↓バンドを切り取った(pSB1C3は観察された2本のバンドのうち、サイズが大きい方を切り取った)
 +
::　↓切り取ったahpC,SufAを別々のエッペンドルフチューブに入れ、pSB1Cは2分割してそれぞれ
 +
::　ahpC,SufAが入ったエッペンに入れた
 +
::　　(以下はこの2つの試料のうち、1試料分の実験手順を書いた)
 +
::　↓フェノールを等量加え、ボルテックス
 +
::　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 +
::　↓上清を回収した
 +
::　↓フェノールクロロフォルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
 +
::　↓5分間遠心した(25℃, 13000 rpm)
 +
::　↓上清を回収した
 +
::　↓酢酸ナトリウムを50 μl,イソプロパノールを800 μl加えた
 +
::　↓10分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓70%エタノールを500 μl加えた
 +
::　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
 +
::　↓16℃に30分間置いた
 +
::　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
 +
::　↓氷上に30分間置いた
 +
::　↓42℃に30分間置いた
 +
::　↓氷上に2分間置いた
 +
::　↓soc培地を900 μl加えた
 +
::　↓37℃で1時間振とう培養した
 +
::　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
 +
::　↓37℃で一晩インキュベートした
 +
 +
:(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ
 +
::　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
 +
::　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え
 +
::　↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 +
::　↓上清を新しいチューブに移した
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 +
::　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
 +
::　↓カラムにMilli Qを100 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 +
::　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 +
::　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 +
::　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓上清を捨て、乾燥させた
 +
::　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilli Qに溶かした
 +
::　このうち1 μlずつとってMilli Qで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　特に結果として示せるものはなかった
 +
::トランスフォーメーションができていれば明日コロニーが観察されると思われる
 +
:(2)　得られた7試料の濃度に関して、
 +
::ahpCの2試料はそれぞれ266ng/μl,390ng/μl,
 +
::sufAの5試料はそれぞれ303ng/μl,223ng/μl,223ng/μl,140ng/μl,302ng/μlであった
 +
::これより、十分な濃度の試料が得られた
 +
 +
== October 6 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
-
== October 7 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内
 +
:Fukuyama,Takeuchi
 +
'''Purpose'''
 +
# Picking up single colony of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC) and DNA miniprep.[Fukuyama]
 +
# Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
 +
:(1)　pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ　[福山]
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),  pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),  DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
 +
::　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
 +
::　ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
 +
::　↓遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 +
::　↓上清を新しいチューブに移した
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 +
::　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 +
::　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 +
::　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 +
::　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓上清を捨て、乾燥させた
 +
::　↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
 +
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 +
::　Premix 2 μl
 +
::　5xsequence buffer 1 μl
 +
::　Primer(1 μM) 1.6 μl
 +
::　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 +
::　総量 10 μl
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表1: PCR設定</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Pre Denature</TD><TD>Denature</TD><TD>Annealing</TD><TD>Extention</TD><TD>+Extention</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>96℃</TD><TD>96℃</TD><TD>50℃</TD><TD>60℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1min</TD><TD>10sec</TD><TD>5sec</TD><TD>4min</TD><TD>∞</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::エタノール沈殿 
 +
::　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 +
::　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた 
 +
::　↓氷上で15分間冷やした
 +
::　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓乾燥させた(よく乾かした)
 +
::　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 +
::　↓95 ℃で2分加熱した
 +
::　↓氷上で冷やした(急冷)
 +
::　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 +
::　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 +
::　↓シークエンス用の蓋をした
 +
::　↓シークエンサーに入れた
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
 +
::DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
 +
::その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
 +
:(2)　十分に正確な塩基配列を読むことができなかった
 +
 +
'''Consideration'''
 +
:(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
 +
::(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
 +
::DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
 +
:(2)　コンタミの可能性が考えられる
 +
 +
== October 7 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:18:00~
-
== October 8 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内
 +
:Fukuyama,Takeuchi
 +
'''Purpose'''
 +
# DNA miniprep of pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC).[Fukuyama]
 +
# Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
 +
:(1)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のアルカリミニプレップ　[福山]
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]
 +
 +
'''Method'''
 +
【実験方法】
 +
 +
:(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
 +
::　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
 +
::　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 +
::　↓上清を新しいチューブに移した
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
 +
::　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 +
::　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 +
::　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 +
::　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓上清を捨て、乾燥させた
 +
::　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした
 +
::　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した
 +
 +
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 +
 +
::　H<SUB>2</SUB>O 全量10 μlになるように調整した
 +
::　Premix 2 μl
 +
::　5xsequence buffer 1 μl
 +
::　Primer(1 μM) 1.6 μl
 +
::　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 +
::　総量 10 μl
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表1: PCR設定</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Pre Denature</TD><TD>Denature</TD><TD>Annealing</TD><TD>Extention</TD><TD>+Extention</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>96℃</TD><TD>96℃</TD><TD>50℃</TD><TD>60℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1min</TD><TD>10sec</TD><TD>5sec</TD><TD>4min</TD><TD>∞</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::エタノール沈殿 
 +
::　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 +
::　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた 
 +
::　↓氷上で15分間冷やした
 +
::　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓乾燥させた(よく乾かした)
 +
::　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 +
::　↓95 ℃で2分加熱した
 +
::　↓氷上で冷やした(急冷)
 +
::　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 +
::　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 +
::　↓シークエンス用の蓋をした
 +
::　↓シークエンサーに入れた
 +
 +
'''Results'''
 +
(1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す
 +
:<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
:<TD COLSPAN="5">表2: 吸光度測定結果</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD ROWSPAN="7"></TD><TD>ahpC-1</TD><TD>ahpC-2</TD><TD>sufA-1</TD><TD>sufA-2</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.066</TD><TD>0.118</TD><TD>1.005</TD><TD>0.022</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.053</TD><TD>0.114</TD><TD>0.681</TD><TD>0.023</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.055</TD><TD>0.111</TD><TD>0.492</TD><TD>0.024</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.048</TD><TD>0.106</TD><TD>0.448</TD><TD>0.016</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.047</TD><TD>0.103</TD><TD>0.328</TD><TD>0.015</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD></TD><TD></TD><TD>0.276</TD><TD></TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>平均</TD><TD>0.0538</TD><TD>0.1104</TD><TD>0.5383</TD><TD>0.02</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>希釈前の濃度<BR>(ng/μl)</TD><TD>269</TD><TD>552</TD><TD>2692</TD><TD>100</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
 +
:(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった
 +
 +
'''Consideration'''
 +
:(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
 +
::次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき
 +
 +
== October 8 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:10:30~
-
== October 9 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内
 +
:Fukuyama,Takeuchi
 +
'''Purpose'''
 +
# DNA miniprep of pSB6A1(ahpC,GFP).[Fukuyama]
 +
# Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
 +
:(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ　[福山]
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ
 +
::　前日から培養していたpSB6A1(ahpC,GFP)を
 +
::　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 +
::　↓上清を新しいチューブに移した
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 +
::　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 +
::　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 +
::　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 +
::　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
 +
::　↓溶出液を4℃で保存した
 +
 +
 +
:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 +
::　Premix 2 μl
 +
::　5xsequence buffer 1 μl
 +
::　Primer(1 μM) 1.6 μl
 +
::　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 +
::　総量 10 μl
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表1: PCR設定</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Pre Denature</TD><TD>Denature</TD><TD>Annealing</TD><TD>Extention</TD><TD>+Extention</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>96℃</TD><TD>96℃</TD><TD>50℃</TD><TD>60℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1min</TD><TD>10sec</TD><TD>5sec</TD><TD>4min</TD><TD>∞</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::エタノール沈殿 
 +
::　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 +
::　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた 
 +
::　↓氷上で15分間冷やした
 +
::　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH<SUB>2</SUB>Oを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 +
::　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 +
::　↓乾燥させた(よく乾かした)
 +
::　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 +
::　↓95 ℃で2分加熱した
 +
::　↓氷上で冷やした(急冷)
 +
::　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 +
::　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 +
::　↓シークエンス用の蓋をした
 +
::　↓シークエンサーに入れた
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　濃度測定をしなかったので、特に結果として残すものはなかった
 +
:(2)　試料ahpC-1に関しては正しい塩基配列を読むことができた
 +
 +
'''Consideration'''
 +
:(2)　ahpC-1以外の試料の正確な塩基配列が読めなかった理由としてDNA濃度が不十分であった可能性がある
 +
 +
== October 9 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
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No experiments.

Latest revision as of 19:17, 25 October 2010


Contents

October 3

>>top

Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

  1. Ligation of pSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP and transform those into the competent cells.[Fukuyama,Kawashima]
  2. Analysis of sequence of pSB1C3(ahpC).[Iwaki]
  3. Cultivate of ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3.[Yoshimura]
  4. PCR of ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dps.[Kawashima,Yoshimura]
(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養　[吉村]
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR　[革島、吉村]

Method

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
＊ライゲーション
　pSB1C3 + SufA
　　　 　+ SufA+GFP
　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
　↓16℃30min
＊トランスフォーメーション
　コンピテントセル100μLずつ加えた
　↓氷上30min
　↓42℃45min
　↓氷上2min
　↓SOC培地900μL加えた
　↓1h振とう培養
　↓ストリーク
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
　↓氷冷 15min.
　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓上清を捨てた
　↓70 % EtOHを50 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓Remove sup.
　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
　↓95 ℃,2 min加熱した
　↓氷冷(急冷)
　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
　↓シークエンス用のゴムのふたをした
　↓シークエンサーにいれた
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
＊ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)0.75ul
テンプレートDNA0.5ul
MgSO42ul
dNTPs2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
Milli Q16.25ul
Total25ul
表2: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃61℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min∞
35サイクル
＊PCR産物の確認
　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
　↓135v,20minで電気泳動
　↓20minEtBr染色
　↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
(2)　明日、シークエンスを確認
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、
ahpC…1482ng/μl
　　2…360ng/μl
sufA1…265ng/μl
　　2…425ng/μl
oxyR1…367ng/μl
　　2…369ng/μl
sodA1…427ng/μl
　　2…340ng/μl
yaiA1…267ng/μl
　　2…481ng/μl
acrAB1…368ng/μl
　　2…557ng/μl
dps1…530ng/μl
　　2…440ng/μl
だった(全量は全て19μl)
＊電気泳動
　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

>>top

Time

19：00~22:30

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. Confirmation of result on which experiment (3) on October 3.[Fukuyama]
  2. DNA miniprep of pSB1C3(BBa_J04450) and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
  3. Digestion of sufA and ahpC by restriction enzymes.[Fukuyama]
  4. Digestion of pSB1C3 by restriction enzymes and agarose gel electrophoresis.[Fukuyama]
(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認　[福山]
(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理　[福山]
(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理　[福山]
(4)　提出用ベクターpSB1C3のカットチェック　[福山]

Method

(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認
　クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した
(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理
　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった
　↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)
　　また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)
　↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた
　↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した
　↓上清を回収した
　↓70 %エタノールを800 μl加えた
　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
　↓上清を除いた
　↓乾燥した
　↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)
　↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした
　↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った
表1: 制限酵素処理1
単位はμl試料1試料2試料3試料4
DNA溶液12.5131313
Buffer H1.51.51.5
EcoRⅠ0.50.5
PstⅠ0.50.5
全量15151513
表2: 制限酵素処理2
試料(μl)
DNA溶液29
Buffer H4
EcoRⅠ1
PstⅠ1
Milli Q5
全量40
(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理
　表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った
表3: sufA(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
SpeⅠ0.5 μl
M buffer2.5μl
H2O1.5 μl
表4: ahpC(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
SpeⅠ0.5 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5 μl
(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック
　ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した
　そして、制限酵素処理した2つの試料と
　制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した
　↓135V ,20分で電気泳動
　↓EtBr で20分間染色
　　バンドを確認した
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ1 μl
SpeⅠ1 μl
M buffer2.5 μl
H2O0.5μl
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
SpeⅠ1 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5μl

Results

(1)　DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。
あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった
(2) (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl
(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。
(*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl　← 6.8倍濃縮
(3)　明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、
フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う
(4)　EcoRⅠ, SpeⅠで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した
他の2試料は予想通りであった

Consideration

(4)　クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる
次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである

October 5

>>top

Time

9:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. Isolation of pSB1C3,ahpC and SufA from agarose gel and ligation and transformation.[Fukuyama]
  2. DNA miniprep of pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)[Takeuchi]
(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション　[福山]
　　　ベクター　： pSB1C3(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
　　　インサート： ahpC,SufA(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ　[竹内]

Method

(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション
　青ゲルを使って、前日に制限酵素処理をしたpSB1C3,ahpC,SufAをそれぞれ電気泳動した
　↓バンドを切り取った(pSB1C3は観察された2本のバンドのうち、サイズが大きい方を切り取った)
　↓切り取ったahpC,SufAを別々のエッペンドルフチューブに入れ、pSB1Cは2分割してそれぞれ
　ahpC,SufAが入ったエッペンに入れた
　　(以下はこの2つの試料のうち、1試料分の実験手順を書いた)
　↓フェノールを等量加え、ボルテックス
　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
　↓上清を回収した
　↓フェノールクロロフォルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
　↓5分間遠心した(25℃, 13000 rpm)
　↓上清を回収した
　↓酢酸ナトリウムを50 μl,イソプロパノールを800 μl加えた
　↓10分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
　↓上清を捨てた
　↓70%エタノールを500 μl加えた
　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)
　↓上清を捨てた
　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
　↓16℃に30分間置いた
　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
　↓氷上に30分間置いた
　↓42℃に30分間置いた
　↓氷上に2分間置いた
　↓soc培地を900 μl加えた
　↓37℃で1時間振とう培養した
　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
　↓37℃で一晩インキュベートした
(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ
　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え
　↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
　↓カラムにMilli Qを100 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilli Qに溶かした
　このうち1 μlずつとってMilli Qで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した

Results

(1)　特に結果として示せるものはなかった
トランスフォーメーションができていれば明日コロニーが観察されると思われる
(2)　得られた7試料の濃度に関して、
ahpCの2試料はそれぞれ266ng/μl,390ng/μl,
sufAの5試料はそれぞれ303ng/μl,223ng/μl,223ng/μl,140ng/μl,302ng/μlであった
これより、十分な濃度の試料が得られた

October 6

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Time

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC) and DNA miniprep.[Fukuyama]
  2. Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
(1)　pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ　[福山]
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)), DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
　ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
　↓遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
　Premix 2 μl
　5xsequence buffer 1 μl
　Primer(1 μM) 1.6 μl
　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
　総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min∞
30サイクル
エタノール沈殿
　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
　↓氷上で15分間冷やした
　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓乾燥させた(よく乾かした)
　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
　↓95 ℃で2分加熱した
　↓氷上で冷やした(急冷)
　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
　↓シークエンス用の蓋をした
　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
(2)　十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
(2)　コンタミの可能性が考えられる

October 7

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18:00~

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福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC).[Fukuyama]
  2. Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
(1)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のアルカリミニプレップ　[福山]
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method 【実験方法】

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした
　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した


(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
　H2O 全量10 μlになるように調整した
　Premix 2 μl
　5xsequence buffer 1 μl
　Primer(1 μM) 1.6 μl
　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
　総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min∞
30サイクル
エタノール沈殿
　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
　↓氷上で15分間冷やした
　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓乾燥させた(よく乾かした)
　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
　↓95 ℃で2分加熱した
　↓氷上で冷やした(急冷)
　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
　↓シークエンス用の蓋をした
　↓シークエンサーに入れた

Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す

表2: 吸光度測定結果
ahpC-1ahpC-2sufA-1sufA-2
0.0660.1181.0050.022
0.0530.1140.6810.023
0.0550.1110.4920.024
0.0480.1060.4480.016
0.0470.1030.3280.015
0.276
平均0.05380.11040.53830.02
希釈前の濃度
(ng/μl)		2695522692100
(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった

Consideration

(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき

October 8

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Time

10:30~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB6A1(ahpC,GFP).[Fukuyama]
  2. Analysis of sequence of pSB1C3(sufA) and pSB1C3(ahpC).[Takeuchi]
(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ　[福山]
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ
　前日から培養していたpSB6A1(ahpC,GFP)を
　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)
　↓溶出液を4℃で保存した


(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
　Premix 2 μl
　5xsequence buffer 1 μl
　Primer(1 μM) 1.6 μl
　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
　総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min∞
30サイクル
エタノール沈殿
　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
　↓氷上で15分間冷やした
　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓乾燥させた(よく乾かした)
　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
　↓95 ℃で2分加熱した
　↓氷上で冷やした(急冷)
　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
　↓シークエンス用の蓋をした
　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　濃度測定をしなかったので、特に結果として残すものはなかった
(2)　試料ahpC-1に関しては正しい塩基配列を読むことができた

Consideration

(2)　ahpC-1以外の試料の正確な塩基配列が読めなかった理由としてDNA濃度が不十分であった可能性がある

October 9

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No experiments.

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