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:(1) 問題なく実験はうまくいった
:(1) 問題なく実験はうまくいった
:(3) 今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
:(3) 今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
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::今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれ  ない。
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::今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。
:(4) 29日の実験ノートに結果を添付
:(4) 29日の実験ノートに結果を添付

Revision as of 07:23, 23 October 2010

Contents

September 26

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Time

9:00~

Member

福山,臼井,革島,中村
Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理 [革島]
(2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理 [中村]
(3) pSB1C3のゲル抽出 [福山]
(4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験 [臼井]

Method

(1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理
 *ミニプレ
   9/15カラム不使用のミニプレ参照
   最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
 *制限酵素処理
   pSB1C3:DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(8本)
   promoter less RFP:DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(3本)
(2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理
 各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)
 の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)
</TR>
表1: 制限酵素処理試薬組成
acrABahpCdpsoxyRsodAsufAyaiA
DNAsol8.8μL5.5μL8.56μL7.1μL6.96μL8.7μL6.2μL
EcoRⅠ
1μL
Pst
1μL
10xH
2.5μL
Milli Q
Final 25μLに調整
(3) pSB1C3のゲル抽出
 4種類の濃度(3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料)
 pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた
 ↓前日に作成した1%青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した
  確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1%アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
 ↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した
 ↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
 ↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
 ↓フェノールを430 μlほど加えた
 ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
 ↓上清を回収
 ↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
 ↓遠心(13,000 rpm、5分間、25℃)
 ↓上清を回収
 ↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
 ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μlずつ加えた
 ↓遠心(14,500 rpm,30分間,4℃)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓TEを11 μlずつ加えた
 ↓冷凍庫で保存
(4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験
 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
 ↓終濃度がlessおよび1nM~1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
 ↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
 ↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min
 ↓上清を除いた
 ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
 ↓全量を蛍光強度測定に用いた
  ※この操作を80分まで行った

Results

(1)
表2: 濁度測定
RFP 1RFP 2RFP 3RFP 4RFP 5RFP 6RFP 7pSB1C3
OD2600.7530.5890.7560.5050.5030.5170.4560.570
DNA濃度1882514725188251262512591129251140014250
全量2829292929292929
(2)明日、ゲル抽予定
(3)吸光度をまだ測っていないので、ゲル抽出が上手くいったのかはわからない

Consideration

(1) 問題なく実験はうまくいった
(3) 今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。
(4) 29日の実験ノートに結果を添付

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