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September 19

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Time

10：00～

Member

古道、竹内、臼井

Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]

(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動

→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3

のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]

(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]

Method

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定

＜材料＞

　　培養済みyaiA on pSB6A1

　　　　　　SufA on pSB6A1

　　　　　　ahpC on pSB6A1

　　　　　　プロモーターレスpSB6A1

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)

　　1xPBS

＜方法＞

　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を

　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した

　↓吸光度測定した

　↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた

　↓37℃、30min、振とう培養した

　↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた

　↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした

　↓蛍光数値の測定をした

(2)　電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション

　11日(14)(15)(16)と手順は同じである

　変更点のみ以下に示す

　ゲル抽出後の濃度より

　　　　X=ベクター(pSB1C3)の量

　　　　Y=プロモーターの量　　　とし、

　ベクターの濃度(94ng/μL)xX　：　プロモーターの濃度xY　＝　1：2

　ベクターの長さ(2072)　　　　　　　プロモーターの長さ

　よりライゲーションの濃度を決定した

表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H₂O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H₂O 2.3μL

　これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク

　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の

　コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養

　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、

　クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした

(5)　AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養

　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

　プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた

　↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)

表2: 吸光度測定結果
1/20	yaiA	SufA	ahpC	プロモーターレスpSB6A1
	0.392	0.420	0.460	0.430
	0.394	0.430	0.460	0.454
0.460	0.430	0.458	0.452

表3: 蛍光数値測定結果

yaiA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.1638	0.1632	0.1647
100μM	0.1459	0.1406	0.1422
10μM	0.1611	0.1652	0.1605
1μM	0.1727	0.1781	0.1789
100nM	0.1578	0.1635	0.1579
10nM	0.1739	0.1795	0.1751
1nM	0.1594	0.1625	0.1598
H₂O₂less	0.1695	0.1695	0.1675

SufA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	2.261	2.318	2.337
100μM	1.552	1.58	1.568
10μM	1.345	1.37	1.37
1μM	1.337	1.343	1.338
100nM	1.384	1.404	1.409
10nM	1.276	1.201	1.284
1nM	1.306	1.288	1.276
H₂O₂less	1.268	1.265	1.272

ahpC
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	12.27	12.64	13.2
100μM	7.322	7.432	7.579
10μM	5.981	6.036	6.112
1μM	4.851	4.899	4.974
100nM	4.181	4.184	4.256
10nM	4.559	4.633	4.689
1nM	4.436	4.381	4.466
H₂O₂less	4.788	4.826	4.931

プロモーターレスpSB6A1
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.3694	0.3775	0.3734
100μM	0.4109	0.407	0.3898
10μM	0.2903	0.2949	0.2925
1μM	0.2692	0.2748	0.2714
100nM	0.3457	0.3414	0.3443
10nM	0.2785	0.2854	0.2838
1nM	0.3217	0.333	0.3311
H₂O₂less	0.2171	0.2207	0.2268

(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった

これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため

ゲル抽出後の吸光度

AcrAB
1回目	0.024
2回目	0.017
3回目	0.005
4回目	0.017
5回目	0.005
Ave	0.0136
濃度	13.6ng/μL

dps
1回目	0.018
2回目	0.016
3回目	0.017
4回目	0.017
5回目	0.017
Ave	0.015
濃度	16.6ng/μL

oxyR
1回目	0.019
2回目	0.018
3回目	0.019
4回目	0.019
5回目	0.019
Ave	0.0188
濃度	18.8ng/μL

ahpC
1回目	0.036
2回目	0.035
3回目	0.035
4回目	0.035
5回目	0.036
Ave	0.035
濃度	35.0ng/μL

sufA
1回目	0.014
2回目	0.018
3回目	0.018
4回目	0.018
5回目	0.017
Ave	0.017
濃度	17.0ng/μL

(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた

37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを

ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる

(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した

次回この培養させた

AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する

(5)　次回、集菌作業を行う

September 20

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Time

10：00～

Member

竹内、革島、中村

Takeuchi,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理　[革島]

(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定　[中村]

Method

(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理

＊培養

　白金耳によるLB培地3mL(＋クロラムフェニコール)へのpSB1C3の培養

＊ミニプレ

　9/15カラム不使用のミニプレ参照

　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした

＊制限酵素処理

　EcoRⅠ、pstⅠを3μL用い、Total　50μLで処理した

(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定

　Overnightで培養したahpC及びsufA各2本のO.D.₆₀₀を測定した

　↓適正であったahpC1本とsufA2本をLB培地(+amp)でO.D.₆₀₀が0.5になるように希釈した

　↓O.D.₆₀₀が0.4～0.6の間にあることを確認し、500μLずつエッペンに分注した(各5本)

　↓終濃度が100nM、50nM、10nM、5nM、1nMとなるように過酸化水素を加えた

　↓37℃、30minインキュベート

　↓cfg.　4℃　10,000rpm　1min

　↓アスピレーターで上清を除いた

　↓ペレットをPBS150μLに溶かし、内100μLを蛍光強度測定に用いた

　　　　＊過酸化水素付加後の時間を20minで2回目を行った

Results

(1)

＊培養

　　残り7本はアートに使用する

＊ミニプレ

表1: ミニプレ結果
	pSB1C3 1	pSB1C3 2
OD₂₆₀	0.581	0.592
DNA濃度	14525ng/μL	14800ng/μL
全量	31μL	33μL

＊制限酵素処理

　　なし

(2)

表2: ahpC、sufAの蛍光強度(1回目)
	ahpC 2	sufA 1	sufA 2
100nM	11.94	1.384	1.151
50nM	11.57	1.348	1.182
10nM	12.22	1.326	1.113
5nM	12.13	1.371	1.210
1nM	12.61	1.319	1.153

表3: ahpC、sufAの蛍光強度(2回目)
	ahpC 2	sufA 1	sufA 2
100nM	16.26	1.384	1.081
50nM	14.75	1.251	1.185
10nM	13.95	1.395	1.352
5nM	16.82	1.295	1.211
1nM	13.90	1.322	1.174

Consideration

(1)　問題なく結果を出せた

(2)　ahpC、sufA共に前回の実験で見られた、10nM前後の濃度で蛍光強度が大きくなる傾向が見られた

これはプロモータ自体の特性という可能性と実験操作のミスが主に考え得る

しかしながら、以前の大腸菌の生存曲線作成時、

作ってから日数のたった過酸化水素の各濃度ストックは揮発性により実験結果に影響が出たという事例がある

次回以降は、過酸化水素ストックの濃度、及び実験操作に留意し、実験を行う予定である

September 21

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Time

9：00～

Member

古道、竹内、臼井、革島、中村、吉村

Furumichi,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理　[革島]

(2)　AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽　[革島]

(3)　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定　[中村]

(4)　promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理　[吉村]

(5)　dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理　[古道]

(6)　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮　[古道、竹内]

Method

(1)　PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理

　＊吸光度測定

　　　100倍希釈で測定した

　＊制限酵素処理

　　　AcrAB 1　　　50μLに対してEcoRⅠ1μL、speⅠ0.5μLでTotal100μLになるよう処理した

　　　AcrAB 2　　　110μLに対してEcoRⅠ1μL、pstⅠ1μLでTotal1500μLになるよう処理した

(2)　AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽

　9月15日のカラム不使用と同様

(3)　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定

　ahpCに関しては、前日から振とう培養していたものと、今日21日に培養したものの2つを行った

　oxyR、sufAに関しては、今日培養したものを使って、実験を行った

　実験操作は20日参照

　　＊前回、H2O2のストックに問題があるのではとの考えが生じた為、H₂O₂の各濃度ストックから作製した

(4)　promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理

　各サンプルを培養した

　　　培養条件: 3時間, 3mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml)

　↓Cfg.14,000 30sec　で遠心した

　↓Cfg.14,000rpm 30sec　で遠心したのち、100ulのsolⅠを加えた

　↓vortexにより懸濁したのちsolⅡを200ul加え、2分後にsolⅢを150ul加えた

　↓Cfg.14,000rpm 10min　で遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた

　↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5min　で遠心した

　↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した

　↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した

　↓上清を取り除き200ulの７０％エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した

　↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ（TOMY micro vac MV-100 30sec）30ulのTE-RNaseに溶解させた

　以上の操作において、solⅠ,solⅡ,solⅢは以下のものを用いた

　　　SolⅠ: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA

　　　SolⅡ: 0.2N NaOH, 1%SDS

　　　SolⅢ: 5M CH₃COOK,CH₃COOH

　制限酵素処理を行うために吸光度を測定した

　吸光度より下表1の組成で制限酵素処理を行った

　ネガティブコントロール用に5μlだけDNAを残した

　これを37℃のインキュベーターに入れた(overnight)

表1: 制限酵素処理
DNA	23.8μl
EcoRⅠ	0.3μl
XbaⅠ	0.3μl
M Buffer	5μl
Milli Q	20.6μl
Total	50μl

(5)　dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)をすでにMixしたプライマー(dps)を

　各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた

　↓下表3のプログラムでPCR反応を行った

　↓電気泳動にかけた

　↓吸光度測定した(100倍希釈)

　↓制限酵素処理を以下の条件で行った

　↓37℃、一晩、インキュベート

表2: PCR試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)	各 0.5μL
10xPCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

表3: dpsのPCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	30sec	2min	保持
	35サイクル

表4: dps 1(284µg/ml)
DNA(dps)	40μl
Buffer H	5μl
H₂O	2.378μl
EcoRⅠ	1.135µl
PstⅠ	1.262µl
total	50µl

表5: dps 2(319μg/ml)
DNA(dps)	40μl
Buffer H	5µl
H₂O	2.307μl
EcoRⅠ	1.276μl
total	50µl

(6)　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮

　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2にDNAの5倍量の100％エタノールを加えた

　↓DNAの1/5倍量のCH₃COONaを加えた

　↓4℃、14,000rpm、20min遠心

　↓上澄みを除き70％エタノールを200µl加えた

　↓4℃、14,000rpm、10min遠心

　↓上澄みを除き30µlのRNase入りのTEを加えた

　　(本来ならこの手順の前に乾燥が必要なのだがここでは行わなかった)

　↓吸光度測定をした

Results

(1)

表5: 吸光度測定
1/100	AcrAB 1	AcrAB 2
OD₂₆₀	0.138	0.357
DNA濃度(ng/μL)	690	1875
全量(μL)	40	110

(2)　吸光度は誤差の範囲でしか得られなかったため、(6)で濃縮を行った

(3)

表6: ahpCの蛍光強度測定
	1nM	5nM	10nM	50nM	100nM
ahpC 1	11.57	11.59	10.82	10.18	5.896
ahpC 2	11.25	11.68	10.94	11.36	8.862

表7　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定
	1nM	5nM	10nM	50nM	100nM	1μM
ahpC	13.55	1.344	13.75	15.34	15.21	12.69
oxyR	6.940	6.185	6.044	6.519	6.046	5.571
sufA	0.2307	0.2296	0.2455	0.2546	0.1985	0.2269

(4)

表8: 吸光度測定結果
1/500	CFP	YFP
1回目	0.148	0.174
2回目	0.147	0.174
3回目	0.143	0.164
4回目	0.147	0.166
5回目	0.143	0.163
平均	0.1456	0.1682
DNA濃度	3460ng/μl	4205ng/μl

(5)　電気泳動の結果、綺麗にバンドが検出され十分なPCR処理が認められた

表9: 吸光度測定結果
1/100	dps 1	dps 2
1回目	0.059	0.069
2回目	0.058	0.067
3回目	0.057	0.065
4回目	0.058	0.059
5回目	0.052	0.059
平均	00568	0.0638
DNA濃度	284μg/ml	319μg/ml

(6)

表10: 吸光度測定結果
	AcrAB	dps	RFP	yaiA 1	yaiA 2
濃度	37.6ng/μl	14.4 ng/μl	17.6ng/μl	19.8ng/μl	13.0ng/μl

Consideration

(2)　切り取ったバンドが太すぎたことが原因であったと考えられる

(3)　今回H2O2を新しく調整して実験を行ったが、前日同様、濃度に比例した蛍光強度は得られなかった

しかし、これは1nM∼100nM付近での現象であり、

全体を通しての傾向ではないので、ペンの機能的には問題ないかと思われる

また、sufAの蛍光強度の結果に関しては、きわめて低い値が出てしまったのは、

おそらく実験操作中に何かしらの操作ミスが考えられる

(4)　DNA濃度が十分であることからプラスミド抽出に成功したと言える

(5)　制限酵素処理したPCR済dpsは次回以降にゲル抽出する

(6)　吸光度測定の結果より、十分な濃度のDNAが取れた

September 22

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