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September 19

Time

10：00～

Member

古道、竹内、臼井

Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]

(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動

→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3

のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]

(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]

Method

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定

＜材料＞

　　培養済みyaiA on pSB6A1

　　　　　　SufA on pSB6A1

　　　　　　ahpC on pSB6A1

　　　　　　プロモーターレスpSB6A1

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)

　　1xPBS

＜方法＞

　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を

　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した

　↓吸光度測定した

　↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた

　↓37℃、30min、振とう培養した

　↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた

　↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした

　↓蛍光数値の測定をした

(2)　電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション

　11日(14)(15)(16)と手順は同じである

　変更点のみ以下に示す

　ゲル抽出後の濃度より

　　　　X=ベクター(pSB1C3)の量

　　　　Y=プロモーターの量　　　とし、

　ベクターの濃度(94ng/μL)xX　：　プロモーターの濃度xY　＝　1：2

　ベクターの長さ(2072)　　　　　　　プロモーターの長さ

　よりライゲーションの濃度を決定した

表1: ライゲーションの試薬組成

AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL

dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL

oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 2.0μL

ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H2O 2.2μL

sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H2O 2.3μL

　これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク

　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の

　コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養

　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、

　クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした

(5)　AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養

　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

　プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた

　↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)

表2: 吸光度測定結果
1/20	yaiA	SufA	ahpC	プロモーターレスpSB6A1
	0.392	0.420	0.460	0.430
	0.394	0.430	0.460	0.454
0.460	0.430	0.458	0.452

表3: 蛍光数値測定結果
yaiA H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 0.1638 0.1632 0.1647 100μM 0.1459 0.1406 0.1422 10μM 0.1611 0.1652 0.1605 1μM 0.1727 0.1781 0.1789 100nM 0.1578 0.1635 0.1579 10nM 0.1739 0.1795 0.1751 1nM 0.1594 0.1625 0.1598 H2O2less 0.1695 0.1695 0.1675			SufA H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 2.261 2.318 2.337 100μM 1.552 1.58 1.568 10μM 1.345 1.37 1.37 1μM 1.337 1.343 1.338 100nM 1.384 1.404 1.409 10nM 1.276 1.201 1.284 1nM 1.306 1.288 1.276 H2O2less 1.268 1.265 1.272
ahpC H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 12.27 12.64 13.2 100μM 7.322 7.432 7.579 10μM 5.981 6.036 6.112 1μM 4.851 4.899 4.974 100nM 4.181 4.184 4.256 10nM 4.559 4.633 4.689 1nM 4.436 4.381 4.466 H2O2less 4.788 4.826 4.931			プロモーターレスpSB6A1 H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 0.3694 0.3775 0.3734 100μM 0.4109 0.407 0.3898 10μM 0.2903 0.2949 0.2925 1μM 0.2692 0.2748 0.2714 100nM 0.3457 0.3414 0.3443 10nM 0.2785 0.2854 0.2838 1nM 0.3217 0.333 0.3311 H2O2less 0.2171 0.2207 0.2268

(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった

これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため

ゲル抽出後の吸光度

AcrAB 1回目 0.024 2回目 0.017 3回目 0.005 4回目 0.017 5回目 0.005 Ave 0.0136 濃度 13.6ng/μL

dps 1回目 0.018 2回目 0.016 3回目 0.017 4回目 0.017 5回目 0.017 Ave 0.015 濃度 16.6ng/μL

oxyR 1回目 0.019 2回目 0.018 3回目 0.019 4回目 0.019 5回目 0.019 Ave 0.0188 濃度 18.8ng/μL

ahpC 1回目 0.036 2回目 0.035 3回目 0.035 4回目 0.035 5回目 0.036 Ave 0.035 濃度 35.0ng/μL

sufA 1回目 0.014 2回目 0.018 3回目 0.018 4回目 0.018 5回目 0.017 Ave 0.017 濃度 17.0ng/μL

(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた

37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを

ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる

(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した

次回この培養させた

AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する

(5)　次回、集菌作業を行う

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