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Contents

September 19

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Time

10:00~

Member

古道、竹内、臼井
Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定 [古道]
(2) AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動
→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション [臼井]
(3) DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3
のコロニーをピックアップ、ストリーク [古道]
(4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養 [古道]
(5) AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養 [古道]

Method

(1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定
<材料>
  培養済みyaiA on pSB6A1
      SufA on pSB6A1
      ahpC on pSB6A1
      プロモーターレスpSB6A1
  各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)
  1xPBS
<方法>
 培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を
 アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した
 ↓吸光度測定した
 ↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに
  各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた
 ↓37℃、30min、振とう培養した
 ↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた
 ↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした
 ↓蛍光数値の測定をした
(2) 電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション
 11日(14)(15)(16)と手順は同じである
 変更点のみ以下に示す
 ゲル抽出後の濃度より
    X=ベクター(pSB1C3)の量
    Y=プロモーターの量   とし、
 ベクターの濃度(94ng/μL)xX : プロモーターの濃度xY = 1:2
 ベクターの長さ(2072)       プロモーターの長さ
 よりライゲーションの濃度を決定した
表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H2O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H2O 2.3μL
 これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした
(3) DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク
 DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の
 コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした
(4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養
 (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、
 クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした
(5) AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養
 AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
 プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた
 ↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)
表2: 吸光度測定結果
1/20yaiASufAahpCプロモーターレスpSB6A1
0.3920.4200.4600.430
0.3940.4300.4600.454
0.4600.4300.4580.452
表3: 蛍光数値測定結果
yaiA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.16380.16320.1647
100μM0.14590.14060.1422
10μM0.16110.16520.1605
1μM0.17270.17810.1789
100nM0.15780.16350.1579
10nM0.17390.17950.1751
1nM0.15940.16250.1598
H2O2less0.16950.16950.1675
SufA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM2.2612.3182.337
100μM1.5521.581.568
10μM1.3451.371.37
1μM1.3371.3431.338
100nM1.3841.4041.409
10nM1.2761.2011.284
1nM1.3061.2881.276
H2O2less1.2681.2651.272
</TR>
ahpC
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM12.2712.6413.2
100μM7.3227.4327.579
10μM5.9816.0366.112
1μM4.8514.8994.974
100nM4.1814.1844.256
10nM4.5594.6334.689
1nM4.4364.3814.466
H2O2less4.7884.8264.931
プロモーターレスpSB6A1
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.36940.37750.3734
100μM0.41090.4070.3898
10μM0.29030.29490.2925
1μM0.26920.27480.2714
100nM0.34570.34140.3443
10nM0.27850.28540.2838
1nM0.32170.3330.3311
H2O2less0.21710.22070.2268
(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった
これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため
ゲル抽出後の吸光度
AcrAB
1回目0.024
2回目0.017
3回目0.005
4回目0.017
5回目0.005
Ave0.0136
濃度13.6ng/μL
dps
1回目0.018
2回目0.016
3回目0.017
4回目0.017
5回目0.017
Ave0.015
濃度16.6ng/μL
oxyR
1回目0.019
2回目0.018
3回目0.019
4回目0.019
5回目0.019
Ave0.0188
濃度18.8ng/μL
ahpC
1回目0.036
2回目0.035
3回目0.035
4回目0.035
5回目0.036
Ave0.035
濃度35.0ng/μL
sufA
1回目0.014
2回目0.018
3回目0.018
4回目0.018
5回目0.017
Ave0.017
濃度17.0ng/μL
(3) コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた
37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを
ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる
(4) (3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した
次回この培養させた
AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する
(5) 次回、集菌作業を行う

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