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Revision as of 08:07, 22 October 2010

Contents

September 19

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Time

10:00~

Member

古道、竹内、臼井
Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定 [古道]
(2) AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動
→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション [臼井]
(3) DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3
のコロニーをピックアップ、ストリーク [古道]
(4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養 [古道]
(5) AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養 [古道]

Method

(1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定
<材料>
  培養済みyaiA on pSB6A1
      SufA on pSB6A1
      ahpC on pSB6A1
      プロモーターレスpSB6A1
  各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)
  1xPBS
<方法>
 培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を
 アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した
 ↓吸光度測定した
 ↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに
  各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた
 ↓37℃、30min、振とう培養した
 ↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた
 ↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした
 ↓蛍光数値の測定をした
(2) 電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション
 11日(14)(15)(16)と手順は同じである
 変更点のみ以下に示す
 ゲル抽出後の濃度より
    X=ベクター(pSB1C3)の量
    Y=プロモーターの量   とし、
 ベクターの濃度(94ng/μL)xX : プロモーターの濃度xY = 1:2
 ベクターの長さ(2072)       プロモーターの長さ
 よりライゲーションの濃度を決定した
表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H2O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H2O 2.3μL
 これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした
(3) DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク
 DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の
 コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした
(4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養
 (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、
 クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした
(5) AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養
 AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
 プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた
 ↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)
表2: 吸光度測定結果
1/20yaiASufAahpCプロモーターレスpSB6A1
0.3920.4200.4600.430
0.3940.4300.4600.454
0.4600.4300.4580.452
表3: 蛍光数値測定結果
yaiA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.16380.16320.1647
100μM0.14590.14060.1422
10μM0.16110.16520.1605
1μM0.17270.17810.1789
100nM0.15780.16350.1579
10nM0.17390.17950.1751
1nM0.15940.16250.1598
H2O2less0.16950.16950.1675
SufA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM2.2612.3182.337
100μM1.5521.581.568
10μM1.3451.371.37
1μM1.3371.3431.338
100nM1.3841.4041.409
10nM1.2761.2011.284
1nM1.3061.2881.276
H2O2less1.2681.2651.272
ahpC
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM12.2712.6413.2
100μM7.3227.4327.579
10μM5.9816.0366.112
1μM4.8514.8994.974
100nM4.1814.1844.256
10nM4.5594.6334.689
1nM4.4364.3814.466
H2O2less4.7884.8264.931
プロモーターレスpSB6A1
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.36940.37750.3734
100μM0.41090.4070.3898
10μM0.29030.29490.2925
1μM0.26920.27480.2714
100nM0.34570.34140.3443
10nM0.27850.28540.2838
1nM0.32170.3330.3311
H2O2less0.21710.22070.2268
(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった
これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため
ゲル抽出後の吸光度
AcrAB
1回目0.024
2回目0.017
3回目0.005
4回目0.017
5回目0.005
Ave0.0136
濃度13.6ng/μL
dps
1回目0.018
2回目0.016
3回目0.017
4回目0.017
5回目0.017
Ave0.015
濃度16.6ng/μL
oxyR
1回目0.019
2回目0.018
3回目0.019
4回目0.019
5回目0.019
Ave0.0188
濃度18.8ng/μL
ahpC
1回目0.036
2回目0.035
3回目0.035
4回目0.035
5回目0.036
Ave0.035
濃度35.0ng/μL
sufA
1回目0.014
2回目0.018
3回目0.018
4回目0.018
5回目0.017
Ave0.017
濃度17.0ng/μL
(3) コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた
37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを
ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる
(4) (3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した
次回この培養させた
AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する
(5) 次回、集菌作業を行う

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