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Revision as of 07:45, 22 October 2010

September 19

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Time

10：00～

Member

古道、竹内、臼井

Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]

(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動

→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3

のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]

(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]

Method

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定

＜材料＞

　　培養済みyaiA on pSB6A1

　　　　　　SufA on pSB6A1

　　　　　　ahpC on pSB6A1

　　　　　　プロモーターレスpSB6A1

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)

　　1xPBS

＜方法＞

　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を

　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した

　↓吸光度測定した

　↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに

　　各濃度のH₂O₂(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた

　↓37℃、30min、振とう培養した

　↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた

　↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした

　↓蛍光数値の測定をした

(2)　電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション

　11日(14)(15)(16)と手順は同じである

　変更点のみ以下に示す

　ゲル抽出後の濃度より

　　　　X=ベクター(pSB1C3)の量

　　　　Y=プロモーターの量　　　とし、

　ベクターの濃度(94ng/μL)xX　：　プロモーターの濃度xY　＝　1：2

　ベクターの長さ(2072)　　　　　　　プロモーターの長さ

　よりライゲーションの濃度を決定した

表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H₂O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H₂O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H₂O 2.3μL

　これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした

(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク

　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の

　コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした

(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養

　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、

　クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした

(5)　AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養

　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1

　プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた

　↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)

表2: 吸光度測定結果
1/20	yaiA	SufA	ahpC	プロモーターレスpSB6A1
	0.392	0.420	0.460	0.430
	0.394	0.430	0.460	0.454
0.460	0.430	0.458	0.452

表3: 蛍光数値測定結果

yaiA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.1638	0.1632	0.1647
100μM	0.1459	0.1406	0.1422
10μM	0.1611	0.1652	0.1605
1μM	0.1727	0.1781	0.1789
100nM	0.1578	0.1635	0.1579
10nM	0.1739	0.1795	0.1751
1nM	0.1594	0.1625	0.1598
H₂O₂less	0.1695	0.1695	0.1675

SufA
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	2.261	2.318	2.337
100μM	1.552	1.58	1.568
10μM	1.345	1.37	1.37
1μM	1.337	1.343	1.338
100nM	1.384	1.404	1.409
10nM	1.276	1.201	1.284
1nM	1.306	1.288	1.276
H₂O₂less	1.268	1.265	1.272

</TR>

ahpC
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	12.27	12.64	13.2
100μM	7.322	7.432	7.579
10μM	5.981	6.036	6.112
1μM	4.851	4.899	4.974
100nM	4.181	4.184	4.256
10nM	4.559	4.633	4.689
1nM	4.436	4.381	4.466
H₂O₂less	4.788	4.826	4.931

プロモーターレスpSB6A1
H₂O₂濃度	1回目	2回目	3回目
1mM	0.3694	0.3775	0.3734
100μM	0.4109	0.407	0.3898
10μM	0.2903	0.2949	0.2925
1μM	0.2692	0.2748	0.2714
100nM	0.3457	0.3414	0.3443
10nM	0.2785	0.2854	0.2838
1nM	0.3217	0.333	0.3311
H₂O₂less	0.2171	0.2207	0.2268

(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった

これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため

ゲル抽出後の吸光度

AcrAB
1回目	0.024
2回目	0.017
3回目	0.005
4回目	0.017
5回目	0.005
Ave	0.0136
濃度	13.6ng/μL

dps
1回目	0.018
2回目	0.016
3回目	0.017
4回目	0.017
5回目	0.017
Ave	0.015
濃度	16.6ng/μL

oxyR
1回目	0.019
2回目	0.018
3回目	0.019
4回目	0.019
5回目	0.019
Ave	0.0188
濃度	18.8ng/μL

ahpC
1回目	0.036
2回目	0.035
3回目	0.035
4回目	0.035
5回目	0.036
Ave	0.035
濃度	35.0ng/μL

sufA
1回目	0.014
2回目	0.018
3回目	0.018
4回目	0.018
5回目	0.017
Ave	0.017
濃度	17.0ng/μL

(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた

37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを

ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる

(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した

次回この培養させた

AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する

(5)　次回、集菌作業を行う

September 20

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September 25

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 == September 19 ==
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+'''Time'''
+:10：00～
+'''Member'''
+:古道、竹内、臼井
+:Furumichi,Takeuchi,Usui
+'''Purpose'''
+:(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]
+:(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動
+::→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]
+:(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3
+::のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]
+:(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]
+:(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
+::プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]
+'''Method'''
+:(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定
+:＜材料＞
+::　　培養済みyaiA on pSB6A1
+::　　　　　　SufA on pSB6A1
+::　　　　　　ahpC on pSB6A1
+::　　　　　　プロモーターレスpSB6A1
+::　　各濃度のH<SUB>2</SUB>O<SUB>2</SUB>(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)
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+::　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を
+::　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した
+::　↓吸光度測定した
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+::　ゲル抽出後の濃度より
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+:(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった
+::これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため
+::ゲル抽出後の吸光度
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+::<TR>
+::<TD>Ave</TD><TD>0.0188</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>濃度</TD><TD>18.8ng/μL</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>ahpC</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>1回目</TD><TD>0.036</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>2回目</TD><TD>0.035</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>3回目</TD><TD>0.035</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>4回目</TD><TD>0.035</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>5回目</TD><TD>0.036</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Ave</TD><TD>0.035</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>濃度</TD><TD>35.0ng/μL</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>sufA</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>1回目</TD><TD>0.014</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>2回目</TD><TD>0.018</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>3回目</TD><TD>0.018</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>4回目</TD><TD>0.018</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>5回目</TD><TD>0.017</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Ave</TD><TD>0.017</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>濃度</TD><TD>17.0ng/μL</TD></TR>
+::</TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
+:(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた
+::37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを
+::ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる
+:(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した
+::次回この培養させた
+::AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する
+:(5)　次回、集菌作業を行う
 == September 20 ==

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