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Template:KIT-Kyoto-week6
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| - | ::<TD | + | ::<TD COLSPAN="3">表2: 制限酵素処理試薬組成</TD></TR> |
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::<TD></TD><TD>OxyR</TD><TD>E0240</TD></TR> | ::<TD></TD><TD>OxyR</TD><TD>E0240</TD></TR> | ||
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:: AcrAB(18番)、AcrAB(26番)、SodA(19番)、yaiA(23番)、ahpC(7番)、TetR(on pSB6)、K121013(pSB6)をストリークした | :: AcrAB(18番)、AcrAB(26番)、SodA(19番)、yaiA(23番)、ahpC(7番)、TetR(on pSB6)、K121013(pSB6)をストリークした | ||
:: このプレートを37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight) | :: このプレートを37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight) | ||
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:(4) High Copy,Low Copyの比較追加実験 | :(4) High Copy,Low Copyの比較追加実験 | ||
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:: Sol3: 5M CH<SUB>3</SUB>COOK,CH3COOH | :: Sol3: 5M CH<SUB>3</SUB>COOK,CH3COOH | ||
| + | :(5) OxyR、pSB1C3 の吸光度測定 | ||
| + | :: 以前保存していたOxyR、pSB1C3(乾燥状態x5)、pSB1C3(30μLスケールx3)についてそれぞれ吸光度測定を行った | ||
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| + | :<TD COLSPAN="6">表4: 2種類のpSB1C3の吸光度</TD></TR> | ||
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| + | :<TD></TD><TD>x1/100 pSB1C3Ⅰ</TD><TD>pSB1C3Ⅱ</TD><TD>pSB1C3Ⅲ</TD><TD>pSB1C3Ⅳ</TD><TD>pSB1C3Ⅴ</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>3回目</TD><TD>0.011</TD><TD>0.008</TD><TD>0.011</TD><TD>0.012</TD><TD>0.005</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>4回目</TD><TD>0.012</TD><TD>0.011</TD><TD>0.012</TD><TD>0.017</TD><TD>0.006</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>5回目</TD><TD>0.012</TD><TD>0.010</TD><TD>0.013</TD><TD>0.010</TD><TD>0.004</TD></TR> | ||
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| + | :: PCRを下表5,6の条件で行った | ||
| + | :: PCRが終わった後、吸光度を測定した | ||
| + | :: この結果を受けて、下表7の組成で制限酵素処理を行った（37℃ overnight） | ||
| + | :<TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | :<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD>表5: PCR試薬組成</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>鋳型DNA</TD><TD>0.5ul</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4ul</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>dNTP</TD><TD>5ul</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>Buffer</TD><TD>5ul</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>MilliQ</TD><TD>33ul</TD></TR> | ||
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| + | :<TD>Total</TD><TD>50ul</TD></TR> | ||
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| + | :<TD COLSPAN="3">表6: PCRプログラム</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>60.2℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>30sec</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR> | ||
| + | :</TABLE></TD> | ||
| + | :<TD></TD><TD></TD> | ||
| + | :<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD>表7: 制限酵素処理</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>DNAsol 99μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>2.36μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>1.31μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>Buffer(H)</TD><TD>15μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>32.33μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>total</TD><TD>150μL</TD></TR> | ||
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前日にPCRを終えたyaiAの吸光度（260nm）を測定した | 前日にPCRを終えたyaiAの吸光度（260nm）を測定した | ||
Revision as of 17:46, 19 October 2010
Contents |
September 12
Time
- 10：00～
Member
- 古道、竹内、革島
- Furumichi,Takeuchi,Kawashima
Purpose
- (1) 一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定 [古道]
- (2) 一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、
- pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出 [古道]
- (3) CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に
- ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ [古道]
- (4) E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養 [革島]
Method
- (1) 一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定
- 遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓吸光度測定(100倍希釈)した
- (2) 一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、
- pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出
- 一晩制限酵素処理したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、
- pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした
- ↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、
- pSB6A1-J04450 (RFPプロモーターあり)と一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、
- プロモーターレスLacZを1％青ゲルに流し50Vで60分間電気泳動した
- ↓ゲルの切り出しができそうなinverted LacZ 2とプロモーターレスLacZのゲルを切り出した
- ↓切りだしたゲルの重さを事前に量った
- ↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
- ↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓保存
- (3) CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に
- ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ
- 以下のUVに照らして光っていたコロニーと光っていなかったコロニーもピックアップし、
- アンピシリン入りのLBプレートにストリークした
- dps(YFP)
- ahp(CFP,YFP)
- OxyR(CFP,YFP)
- SufA(CFP)
- SodA(CFP)
- ↓37℃、一晩インキュベートした
- (4) E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養
- E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養
- 3μLのLB培地のはいった、オートクレーブ済みの試験官に3μLずつamp50mL/mgを加えた
- ↓E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,SufA,SodA,yaiAをそれぞれ2本ずつ試験官に植菌した
- OxyRは4本植菌した
- ↓over nightでインキュベート
Results
- (1) 吸光度測定結果を以下に示した
吸光度測定(100倍希釈) 0.023 0.021 0.011 0.012 0.017 0.012 0.017 0.019 平均 0.017 濃度 0.017×100×50＝85(µl/ml)
- (2) ゲル抽出したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、
- pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZらを次回吸光度測定しDNA濃度を求める
- その結果DNA濃度は薄く実験に使用できる濃度に満たなかった
- (3) ストリークしたdps(YFP)、ahp(CFP,YFP)、OxyR(CFP,YFP)、SufA(CFP)、SodA(CFP)は
- 次の日にすべて生えていたのが確認できた
- (4) 全て生えていた
September 13
Time
- 9:00～
Member
- 福山,竹内,中村,吉村
- Fukuyama,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)のアルカリミニプレップ [中村]
- (2) GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)の制限酵素処理 [中村]
- (3) 過酸化水素の反応実験 [吉村]
- (4) High Copy,Low Copyの比較追加実験 [吉村]
- (5) OxyR、pSB1C3 の吸光度測定 [中村]
- (6) acrABのPCR・制限酵素処理 [吉村]
- (7) yaiAの吸光度測定と制限酵素処理 [福山]
- (8) ゲル抽出を終えたInverted LacZとｐSB1A2(BBa_I732019)の吸光度測定 [福山]
- (9) 新しいマスタープレートの作成 [福山]
- DH5α: pSB1A2(BBa_E0240)
- pSB1A2(BBa_I13507)
- pSB1A2(BBa_R0040)
- pSB1A2(BBa_I13522)
- pSB1K3(BBa_I1732950)
- pSB1A2(BBa_J22005)
- pSB1A2(BBa_E0420)
- pSB4A5(BBa_K193602)
- (10) マスタープレートから液体培地への植え継ぎ [福山]
- DH5α: pSB6A1(BBa_J04450)
- pSB1A2(BBa_E0420)
- pSB3K3(BBa_J04450)
- pSB1A2(BBa_E0430)
Method
- (1) GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)のアルカリミニプレップ
- GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)について同様の操作を行った
- (以下、OxyR、E0240と記載)
- 菌液は試験管2本分(約6mL)である
- 1.5mLエッペンドルフチューブに菌液を移した
- ↓cfg 20℃ 13,000rpm 1min
- ↓上清を捨てた(以上の操作を菌液を全量使うまで行う)
- ↓冷蔵していたSolutionⅠ250μｌ加えてピペッティングし、Vortexで混合
- ↓SolutionⅡを250μl加え、軽く振った
- ↓SolutionⅢを350μl加え、タンパク質が生じるまでよく混合
- ↓cfg 20℃ 13,000pm 5min*
- ↓上清をカラムに移した
- ↓cfg 20℃ 13,000pm 1min
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓cfg 20℃ 13,000pm 1min
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓cfg 20℃ 13,000pm 1min(×2)
- ↓抽出液を捨てた(×2)
- ↓滅菌水100μLをカラムに入れた
- ↓cfg 20℃ 13,000pm 1min
- ↓溶出液を回収
- *OxyRに関して、一回の遠心で十分な上清が得られなかった為、
- cfg 20℃ 14,500rpm 3minで再度上清とタンパク質を分離した
- しかしながら、結局カラム上部の半分程度しかOxyRの上清は得られなかった
- (2) GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)の制限酵素処理
- ミニプレ後のOxyR、E0240を制限酵素処理するために濃度を測定した
- 吸光度の測定結果を以下の表1に示した
- 表1より各濃度は
- OxyR 180ng/μL
- E0240 792ng/μL であった
- この結果を受けて、下表2の組成で制限酵素処理を行った
表1: OxyR、E0240の吸光度 ×1/100 OxyR E0240 1回目 0.036 0.170 2回目 0.035 0.155 3回目 0.036 0.156 4回目 0.036 0.158 5回目 0.034 0.153 Ave. 0.036 0.158 表2: 制限酵素処理試薬組成 OxyR E0240 DNAsol 99μL 92μL EcoRⅠ 1.78μL 8.2μL XbaⅠ 1.98μL 9.0μL Buffer M 15μL 15μL H2O 32.2μL 25.8μL total 150μL 150μL
- (3) 過酸化水素の反応実験
- プレートを8分割して、それぞれの区画に時計回りに
- AcrAB(18番)、AcrAB(26番)、SodA(19番)、yaiA(23番)、ahpC(7番)、TetR(on pSB6)、K121013(pSB6)をストリークした
- このプレートを37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight)
- (4) High Copy,Low Copyの比較追加実験
- pSB6 TetR-GFP
- pSB1A2 I13522 を各2本ずつ試験管に培養した
- 培養後、プラスミド抽出をした
- 各サンプルを培養した
- (培養条件 時間 mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml))
- ↓Cfg.14,000rpm 30secで遠心したのち、50ulのsol3を加えた
- ↓本来ならばsol1を加えるところを間違えたので400ulのsol1で懸濁し、洗った
- ↓Cfg.14,000rpm 30secで遠心したのち、100ulのsol1を加えた
- ↓vortexにより懸濁したのちsol2を200ul加え、2分後にsol3を150ul加えた
- ↓Cfg.14,000rpm 10minで遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた
- ↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
- ↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
- ↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除き200ulの70％エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ(TOMY micro vac MV-100 30sec)50ulのmilliQに溶解させた
- 以上の操作において、sol1,sol2,sol3は以下のものを用いた
- Sol1: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA
- Sol2: 0.2N NaOH, 1%SDS
- Sol3: 5M CH3COOK,CH3COOH
- (5) OxyR、pSB1C3 の吸光度測定
- 以前保存していたOxyR、pSB1C3(乾燥状態x5)、pSB1C3(30μLスケールx3)についてそれぞれ吸光度測定を行った
表3: OxyRの吸光度 x1/20 OxyR 1回目 0.022 2回目 0.020 3回目 0.020 4回目 0.024 5回目 0.020 Ave. 0.0225 表4: 2種類のpSB1C3の吸光度 x1/100 pSB1C3Ⅰ pSB1C3Ⅱ pSB1C3Ⅲ pSB1C3Ⅳ pSB1C3Ⅴ 1回目 0.011 0.008 0.013 0.008 0.005 2回目 0.012 0.007 0.016 0.008 0.007 3回目 0.011 0.008 0.011 0.012 0.005 4回目 0.012 0.011 0.012 0.017 0.006 5回目 0.012 0.010 0.013 0.010 0.004 Ave.
- pSB1C3Ⅰ～ⅢはpSB1C3(30μLスケールx3)であり、pSB1C3Ⅳ、ⅤはpSB1C3(乾燥状態x5)の内の2本である
- (6) acrABのPCR・制限酵素処理
- PCRを下表5,6の条件で行った
- PCRが終わった後、吸光度を測定した
- この結果を受けて、下表7の組成で制限酵素処理を行った（37℃ overnight）
表5: PCR試薬組成 鋳型DNA 0.5ul MgSO4 4ul dNTP 5ul KODplus 1ul Primer(PM)
(AcrAB)1.5ul Buffer 5ul MilliQ 33ul Total 50ul 表6: PCRプログラム 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 30sec 2min 保持 35サイクル 表7: 制限酵素処理 DNAsol 99μL EcoRⅠ 2.36μL SpeⅠ 1.31μL Buffer(H) 15μL H2O 32.33μL total 150μL
7)
前日にPCRを終えたyaiAの吸光度（260nm）を測定した
吸光度の測定結果を以下に示す yaiAの吸光度
×1/20 yaiA 1回目 0.386 2回目 0.376 3回目 0.384 4回目 0.376 5回目 0.371 Ave. 0.3786
この結果を受けて、以下の組成で制限酵素処理を行った（37℃ Overniht）
DNAsol 226μL
EcoRⅠ 8.6μL
SpeⅠ 4.8μL
Buffer（H） 41.1μL
H2O 130.6μL
total 411μL
(8)
前日にPCRを終えたInverted lacZと、ｐSB1A2(BBa_I732019)吸光度（260nm）の測定を行った
(9)
Amp入りのLB寒天培地にある DH5α:
pSB1A2(BBa_E0240) pSB1A2(BBa_I13507) pSB1A2(BBa_R0040) pSB1A2(BBa_I13522) pSB1K3(BBa_I1732950) pSB1A2(BBa_J22005) pSB1A2(BBa_E0420) pSB4A5(BBa_K193602)
を、新たにAmp入りの(pSB1K3(BBa_I1732950)はカナマイシン入りの)
LB寒天培地にストリークして37℃でインキュベートした
(10) LB寒天培地にある DH5α:
pSB6A1(BBa_J04450) pSB1A2(BBa_E0420) pSB3K3(BBa_J04450) pSB1A2(BBa_E0430)
をpSB1A2,ｐSB6A1はAmp入りの3mlLB液体にうえつぎして、 pSB3K3はカナマイシン入りの3mlLB液体にうえつぎして一晩培養した 【実験結果】 (1),(2) 37℃で3.5hインキュベートの後、OxyR、E0240共に冷蔵保存した
(3)全ての大腸菌でコロニーの生育が確認できた。 肉眼による蛍光強度は、TetRが最も強く、ahpCがその次に強かった。
AcrAB,SodA,yaiAに関しては蛍光がみられなかった。(蛍光タンパク質を発現しないK121013と蛍光強度が同じくらいだった)
(4)どちらのベクターとも十分なDNA濃度だった。
(5)吸光度測定の結果、このままの状態で制限酵素処理には移れないと判断したため、 14日に濃縮予定
(6) 吸光度の測定結果を以下に示す
表４ acrABの吸光度
×1/100 acrAB 1回目 0.049 2回目 0.047 3回目 0.048 4回目 0.047 5回目 0.047 Ave. 0.0476
表４よりacrABの濃度は 238ng/μL であった
(7)制限酵素処理がうまくいっているかどうかは今日はまだ分からない
(8)Inverted lacZと、ｐSB1A2(BBa_I732019)吸光度（260nm）の測定の結果を示す
Inverted lacZの吸光度
×1/20 Inverted lacZ 1回目 0.017 2回目 0.020 3回目 0.020 4回目 0.019 5回目 0.019 Ave. 0.019
この結果をもとに算出したInverted lacZの濃度：95ng/μl
ｐSB1A2(BBa_I732019)の吸光度
×1/20 ｐSB1A2(BBa_I732019) 1回目 0.012 2回目 0.019 3回目 0.018 4回目 0.014 5回目 0.013 Ave. 0.0152
この結果をもとに算出したｐSB1A2(BBa_I732019)の濃度：15.2ng/μl (9)きちんと培養できているかは今日はまだわからない (10)明日以降、培養が成功していればにアルカリミニプレップを行う 【考察】 (1)OxyRの上清が十分に得られなかった理由として、Overnightで振とう培養（常温）したため菌体が増えすぎた可能性が考えられる
(8) Inverted lacZ、 ｐSB1A2(BBa_I732019)ともにあまり濃いDNA試料とはいえない
September 14
September 15
【時間】
- 9:00～
【実験担当】
- 臼井,革島,竹内,中村,吉村
【実験目的】
- (1) カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験
- (2) ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション
- (3) 本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理
- (4) 過酸化水素濃度比較実験
【実験内容】
- (1) カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験
- RFP(promoterless, on pSB6A1)を試験管6本
- GFP(AcrAB, on pSB6A1)を試験管に4本
- GFP(dps, on pSB6A1)を試験管に4本
- それぞれ37℃のインキュベーターに3時間入れて振とう培養した
- ↓培養後、半分をカラム不使用のアルカリミニプレップで処理し、
- 半分をカラムを使用したアルカリミニプレップで処理した
- カラム不使用のアルカリミニプレップで処理したものをⅠ、
- カラムを使用したアルカリミニプレップで処理したものをⅡとして実験手順をを以下に示す
- [Ⅰ]
- 培養した大腸菌を1.5mlエッペンに移し、25℃、15,000rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓Solution１を250μl加え、ピペッティング、ボルテックスした
- ↓Solution２を250μl加え、4~5回上下して混ぜた
- ↓Solution３を350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに流した
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を捨てた
- ↓Solution４を500μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を捨てた
- ↓Solution５を700μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を捨て、もう一度25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
- ↓Milli Qを100μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓カラムを捨て、エッペンにイソプロパノール 800μl,CH3COONa 50μlを加えた
- ↓25℃、13,000rpmで10分間遠心した
- ↓上層を捨て、70％エタノールをエッペンの8割程まで加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を捨てた
- ↓遠心乾燥器にかけた
- ↓TEを30μl加えた
- ↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した
- [Ⅱ]
- 菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
- ↓4℃、6,000rpmで2分間遠心した
- ↓上清を捨てた
- ↓この操作を菌液がすべてなくなるまで繰り返した
- ↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌
- ↓常温で5分間放置した
- ↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた
- ↓氷上で5分間放置した
- ↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌した
- ↓氷上で5分間放置した
- ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌した
- ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
- ↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した
- ↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した
- ↓常温で10分間放置した
- ↓4℃、15,000rpmで12分間遠心した
- ↓上層を取り除いた
- ↓70%EtOH 500μLを加えた
- ↓4℃、15,000rpmで3分間遠心した
- ↓EtOHを除いた
- ↓2分間遠心乾燥した
- ↓滅菌水30μLに溶かした
- ↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した
- (2) ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション
右表に従い試薬を加え、これを4℃で30分間放置した
(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓70%EtOH 100μLを加えた
↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓2分間乾燥させた(pSB1C3は追加でさらに4分間乾燥した)
↓MilliQ 30μLを加えた
↓それぞれにOrange Loadong Dye 6μLを加えた
↓1kbpマーカーとともに50Vで60分間電気泳動を行った
↓ゲルの切り出、その重さを量った
↓ゲルの三倍量のBuffer QGを加え、50℃で10分間インキュベートした
(インキュベートの間は2、3分毎に振り混ぜた)
↓pSB1C3のみにCH3COONaを3μL加えた
↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓得られた溶液の内5μLを濃度測定に使用した
DNA CH3COONa 95%EtOH 計 pSB1C3 100 10 330 440 AcrAB 150 15 330 495 E0240 150 15 330 495 OxyR 150 15 330 495
- E0240(ハイコピーベクター)、各種プロモーターのLigationを以下の手順で行った
- insert:vector=1:2
- 下表1～3に従い試薬を調整した
- ↓これらを16℃のウォーターバスに30分間つけた
- ↓LigationしたsufA,ahpC,SodA(E0240)全量にDH5αを50μL加え3分間氷上に置いた
- ↓43℃で3分間ヒートショックを与えた
- ↓10分間氷上に置いた
- ↓SOC培地0.9mlを加え、37℃で30分間回復培養を行った
- ↓これをプレートにまき、37℃で培一晩養した
1.SufA Insert(SufA) 0.87μl Vevtor(E0240) 5μl MilliQ 4.13μl Ligation Mix 10μL Total 20μl 2.ahpC Insert(ahpC) 0.85μl Vevtor(E0240) 5μl MilliQ 4.25μl Ligation Mix 10μL Total 20μL 3.SodA Insert(SodA) 2.01μl Vevtor(E0240) 5μl MilliQ 2.99μl Ligation Mix 10μL Total 20μl
- (3) 本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理
- 以下の組成とプログラムでSodA,sufA,ahpC,OxyRの各プロモーターについて2本ずつPCR処理を行った
プライマー(PM)
(SodA,sufA,ahpC,OxyR)0.75ul テンプレートDNA 0.25ul MgSO4 2ul dNTP 2.5ul KODplus 0.5ul Buffer 2.5ul MilliQ 16.5ul Total 25ul Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 35サイクル PCRの後に吸光度を測り、濃度を求めた(実験結果に詳細を示す)
次に右表の組成で制限酵素処理を行った
↓37℃でインキュベートを行った＜組成＞ DNA 49μl EcoRⅠ 1μl PstⅠ 1μl H Buffer 6μl Milli Q 3μl Total 60μl
- (4) 過酸化水素(H2O2)の付加実験
- 実際にH2O2を加え、H2O2応答性プロモーターを挿入したpSB6を培養した場合に、
- 目で見ただけでGFPの蛍光強度の変化がみられるのか確認した
- その方法を以下に示す
- 実験で使用する菌液(yaiA-GFP on pSB6)を用意した
- 菌液がO.D.600＝0.3~0.4になるようにLB培地(+amp)を加え、調整した
- ↓目的の濁度に到達した菌液を短時間37℃で振とう培養し、O.D.600≒0.5にした
- ↓※以降菌液は氷上で操作した
- ↓菌液2mLを分注し、これにそれぞれ終濃度が1mM,1μM,1nMになるようにH2O2を付加した
- ↓37℃,30min.で振とう培養した。
- ↓GFPイルミネーターを使用し、各濃度の蛍光の具合について確認した
終濃度 Negative control 1mM 1μM 1nM 加えたH2O2 - 1M H2O2…2μL 1mM H2O2…2μL 1μM H2O2…2μL
- (1) RFP,GFP(acrAB),GFP(dps)の吸光度測定の結果を以下に示す
- [Ⅰ]
RFP
(×1/100)GFP(acrAB)
(×1/100)GFP(dps)
(×1/100)吸光度 0.0184 0.0194 0.0032 DNA濃度 92ng/μL 97ng/μL 16ng/μL 全量 29μL 29μL 29μL
- [Ⅱ]
RFP1
(×1/100)RFP2
(×1/200)GFP(acrAB)1
(×1/200)GFP(acrAB)2
(×1/200)GFP(dps)1
(×1/100)GFP(dps)2
(×1/100)RFP3
(×1/200)RFP4
(×1/200)吸光度 0.1514 0.633 0.7984 0.6255 0.7554 0.5416 0.792 0.779 DNA濃度 757ng/μL 6,330ng/μL 7,984ng/μL 6,255ng/μL 3,777ng/μL 2708ng/μL 7,920ng/μL 7,790ng/μL 全量 28μL 29μL 29μL 29μL 29μL 29μL 29μL 29μL
- (2) 電気泳動の結果
- OxyRのバンドが見られなかった
- ゲル抽出の結果を以下に示す
pSB1C3(1/20) E0240(1/20) AcrAB(1/20) OD260 0.094 0.014 0.028 DNA濃度(ng/μL) 94 14 28 全量(μL) 32 32 32
- トランスフォーメイションの結果を以下に示す
- AcrAB以外のプレートからはコロニーが見られなかった
- (3) PCR後に測定した吸光度の値を以下にまとめた
OxyR SufA SodA ahpC 吸光度 0.0646 0.0464 0.0534 0.0468 DNA濃度 323ng/μL 232ng/μL 267ng/μL 234ng/μL 全量 49μL 49μL 49μL 49μL
- (4) 菌液を10倍希釈したときyaiAの濁度の平均は0.652だったので、1.5倍に希釈して濁度を測った
- この値が0.464であったので15分間培養したところ吸光度が0.7908になったため2倍に希釈して3分間培養し、
- このときの吸光度が0.490であったので、これを氷上で使用し実験を行った
測定した濁度 yaiA(10倍希釈) yaiA(15倍希釈) yaiA(30倍希釈) 1 0.660 0.466 0.796 2 0.662 0.462 0.798 3 0.652 0.462 0.784 4 0.656 0.466 0.790 5 0.658 0.464 0.786 Average 0.6518 0.464 0.7908
- Negative controlとH2O2を付加したもの各3種をGFPのイルミネーターにより肉眼で確認したところ、
- 少しNegative controlの方が暗いような印象はあったが、明瞭に光度が違うとは言えない状況であった
- (1) カラム不使用のアルカリミニプレップのほうが比較的収率が良い結果となった
- RFP1のDNA濃度が著しく低かったのは、操作中にDNAを吸ってしまったなど実験上の操作ミスの可能性が考えられる
- (2) OxyRのバンドが見られなかったのは青ゲルを使ったためバンドが良く見られなかったことが一因であると考えられる
- pSB1C3のゲル抽の結果はあまりよくなかった
- これはQGを加えてゲルを溶かした溶液の色が紫色であったため、
- キアゲンのキットの取り扱い方に従ってCH3COONa 30μLを加えてpH調整を試みたが、溶液の色に変化はなかった
- 結果から考えて溶液の紫色は青ゲルが原因であったと考えられる
- またpH調整を試みたことによってDNAがいくらかロスされたと思われる
- AcrAB以外のプレートからコロニーが得られなかったのは、ゲル抽出後の吸光度は確認されたので、
- ライゲーションにおいてプラスミドを精製することができなかったためと考えられる
- (3) 結果よりDNA濃度が十分であるので、PCRに成功したといえる
- (4) 蛍光強度を測る吸光度系のセルが届き次第そちらで同様の実験をし、
- 数値としてのGFP光度の違いを測定しようと思う
