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Contents

September 5

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September 6

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【時間】

8:30～20:30

【実験担当】

岩城

【実験目的】

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する
(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える。AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する。

【実験内容】

(1)　プラスミド抽出
　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)
(2)　制限酵素処理
　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した
(3)　ゲル抽出
　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)
(4)　LigationとTrans formation
　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った
　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと
　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　
　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

【実験結果】

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
それ以外に関してはTFまで完了した
以下の計5種
　　pSB6A1(E0430)
　　pSB6A1(E0420)
　　pSB6A1(K362007)
　　pSB6A1(K362011)
　　pSB6A1(K362013)

【実験考察】

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

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【時間】

9：00～

【実験担当】

岩城、竹内、中村、福山

【実験目的】

(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),
DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),
DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ
(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

【実験内容】

(1)　コロニーをピックアップ
　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))
　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))
　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))
　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))
　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))
　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
　↓37℃でインキュベートした
(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた
　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした
　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した
　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた
　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた
　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
　↓上清を捨てた
　↓遠心乾燥機で乾燥した
　↓MilliQを30μl加えた
　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)
　↓100倍希釈で吸光度を計測した
　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた
　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした
＜表1＞吸光度計測結果
AD2600.071
0.069
0.069
0.07
0.071
平均0.07
＜表2＞試薬組成
AcrAB24μl
EcoRⅠ0.84μl
PstⅠ0.933μl
H Buffer2.6μl
MilliQ21.6μl
全量約50μl


(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした
　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を回収した
　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた
　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した
　↓MilliQを30μl加えた

【結果】

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する
(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

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