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From 2010.igem.org

August 31

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城,福山,古道,吉村

【実験名】

(1)　pSB1A2(BBa_E0420:CFP),pSB1A2(BBa_E0430:YFP),pSB1A2(BBa_I13507:RFP)のアルカリミニプレップ、カットチェック

(2)　アルカリミニプレップを終えたｐSB6A1(BB_K121013)のカットチェック

(3)　hemH,dps,yaiAのPCR

【実験目的】

(1)　pSB1A2(BBa_E0420:CFP),pSB1A2(BBa_E0430:YFP),pSB1A2(BBa_I13507:RFP)のアルカリミニプレップ、カットチェック

(2)　アルカリミニプレップを終えたｐSB6A1(BB_K121013)のカットチェック

(3)　hemH,dps,yaiAのPCR

【実験内容】

(1)　アルカリミニプレップ、カットチェック

DH5α pSB1A2(BBa_E0420:CFP),pSB1A2(BBa_E0430:YFP),pSB1A2(BBa_I13507:RFP)を それぞれ1.5mlエッペンチューブにうつした ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した ↓上清を捨てた ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした ↓SolutionⅡを250μl加えた ↓SolutionⅢを350μl加えた ↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した ↓上清をカラムに入れた ↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した ↓抽出液を捨てた ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した ↓抽出液を捨てた ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した ↓抽出液を捨てた ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した ↓抽出液を捨てた ↓滅菌水をカラムに入れた ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した ↓溶出液を回収した ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、 　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥した ↓MilliQを30μl加えた ↓右の表1通りに調整した溶液を135Vで15分間電気泳動した

＜表1＞ DNA溶液 5μl Buffer H 2μl EcoRⅠ 0.75μl PstⅠ 0.75μl Milli Q 11.5μl 全量 20μl

(2)　アルカリミニプレップを終えたｐSB6A1(BB_K121013)のカットチェック

アルカリミニプレップを終えたpSB6A1(BBa_K121013)に 　　　1. ahpを挿入したもの 　　　2. sufAを挿入したもの 　　　3. プロモーターレスのもの の溶液を右の表2のように、それぞれ4つないし3つ試料を作成し、 135Vで15分間電気泳動をした(試料4は3.のみ)

＜表2＞ DNA溶液 BufferM EcoRⅠ XbaⅠ PstⅠ MilliQ 試料1 10μl 2μl 1μl 7μl 試料2 10μl 2μl 1μl 7μl 試料3 10μl 2μl 1μl 7μl 試料4 10μl 10μl

(3) プライマー（Forward）、プライマー（Reverse）をすでにMixしたプライマー(hemH, dps, yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた 　　　　　　　　　　↓　　　　　 それぞれのエッペンに以下の組成で溶液を加えた テンプレートDNA(DH5α)各 0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs　5μL 2mM MgSO₄4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL 　　　　　　　　　　↓ 以下のプログラムでPCR反応を行った。 (hemH,dps,yaiAのPCR反応) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 38sec 2min 保持 30サイクル 　　　　　　　　　　↓ PCR産物を電気泳動にかけ今後使用できるものか確認した 【実験結果】 （1） 3kb~4kbあたりと、1kbあたりにバンドが確認できた。これはそれぞれベクター、 インサートの大きさと一致するので、制限酵素処理は成功していると思われる。 （2） ①→試料1 6kbあたりにバンドが1本見られた 　　 試料2 6kbあたりにバンドが1本見られた 　　 試料3　　5kbあたりにバンドが1本見られた ※GFPの発現があまり見られなかった大腸菌と、GFPの発現が顕著に見られた大腸菌　 　の両方で確認した結果、前者は試料1にはバンドが確認できなかった　　 ※何故、制限酵素が違うとバンドの大きさも違ったのかよく分からなかった。 ②→試料1　　6kbあたりにバンドが1本見られた 　　 試料2　　6kbあたりにバンドが1本見られた 　　 試料3　　6kbあたりにバンドが1本見られた ③→試料1　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた 　　 試料2　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた 　　 試料3　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた 　　 試料4　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた 　　　　　→③のプラスミドは理想通りの結果が得られなかったので、破棄することにした (3)PCR産物の電気泳動の結果、すべてバンドが検出されたので今後使用するものとする 　　だが、hemHのバンドは他のものに対し薄かった