Template:KIT-Kyoto-Augsut29

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August 29

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Time

9:00~

Member

岩城,古道,竹内,中村,臼井
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui

Purpose

(1) pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定 [古道]
(2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR [古道]
(3) SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認 [岩城]
(4) pSB6A1(K121013)のmidiprep [竹内]


Method

(1) pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
 前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した
 ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μl加えた
 ↓SolutionⅢを350μl加えた
 ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 ↓上清をカラムに加えた
 ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓滅菌水をカラムに入れた
 ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った
 ↓溶出液を回収
 ↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った


(2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
 プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
 Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
 ↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた
 ↓下に示したプログラムでPCR反応を行った
 ↓PCR産物を電気泳動にかけた
テンプレートDNA各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-5μL
2mM d NTPs5μL
2mM MgSO44μL
MilliQ33μL
KOD-Plus-1μL
(ahpC,OxyR)
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃62.2℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min保持
30サイクル
(hemH,dps)
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃60℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec33sec2min保持
30サイクル
(3) SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認
 PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った
 1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した
(4) pSB6A1(K121013)のmidiprep
 カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した
 前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml
 ↓R3を4 ml加えてボルテックスした
 ↓L7を4 ml加えて5 min放置した
 ↓N3を4 ml加えた
 ↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した
 ↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた
 ↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した
 ↓カラムにE4を5 ml加えた
 ↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた
 ↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した
 ↓70 %エタノールを3 ml加えた
 ↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した
 ↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた
 ↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した

Results

(1)
吸光度測定結果
0.059
0.055
0.062
0.059
0.070
平均0.061


この値から計算して、
DNA濃度:0.061×100×50=3.05×10²(μg/ml)

電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された
(2) PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
(3) SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた
 OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した
(4) 冷蔵庫で保管した