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Template:KIT-Kyoto-Augsut29
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Revision as of 07:19, 15 September 2010
August 29
【時間】
- 9:00～
【実験担当】
- 岩城,古道,竹内,中村,臼井
【実験目的】
- (1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
【実験内容】
- (1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
- 前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した
- ↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心５分（20℃、14500rpm）
- ↓上清をカラムに加えた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓20℃、14500rpmで1分間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓20℃、14500rpmで30秒間遠心を行った
- ↓溶出液を回収
- ↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
- Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた
- ↓下に示したプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR産物を電気泳動にかけた
テンプレートDNA 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO₄ 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL
(ahpC,OxyR) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル (hemH,dps) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 33sec 2min 保持 30サイクル
【実験結果】
- (1)
吸光度測定結果 0.059 0.055 0.062 0.059 0.070 平均 0.061 - この値から計算して、
- DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)
- 電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された
- (2) PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
