"
Template:KIT-Kyoto-Augsut29
From 2010.igem.org
(Difference between revisions)
(→Augsut 29) |
Matsubara3 (Talk | contribs) (→No title) |
||
| Line 1: | Line 1: | ||
== August 29 == | == August 29 == | ||
| - | === | + | 【時間】 |
| + | :9:00～ | ||
| + | |||
| + | 【実験担当】 | ||
| + | :岩城,古道,竹内,中村,臼井 | ||
| + | |||
| + | 【実験目的】 | ||
| + | :(1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定 | ||
| + | :(2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR | ||
| + | |||
| + | 【実験内容】 | ||
| + | :(1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定 | ||
| + | :: 前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した | ||
| + | :: ↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌した | ||
| + | :: ↓上清を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした | ||
| + | :: ↓SolutionⅡを250μl加えた | ||
| + | :: ↓SolutionⅢを350μl加えた | ||
| + | :: ↓遠心５分（20℃、14500rpm） | ||
| + | :: ↓上清をカラムに加えた | ||
| + | :: ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm） | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた | ||
| + | :: ↓20℃、14500rpmで1分間遠心した | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた | ||
| + | :: ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm） | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm） | ||
| + | :: ↓抽出液を捨てた | ||
| + | :: ↓滅菌水をカラムに入れた | ||
| + | :: ↓20℃、14500rpmで30秒間遠心を行った | ||
| + | :: ↓溶出液を回収 | ||
| + | :: ↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った | ||
| + | |||
| + | |||
| + | :(2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR | ||
| + | :: プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を | ||
| + | :: Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた | ||
| + | :: ↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた | ||
| + | :: ↓下に示したプログラムでPCR反応を行った | ||
| + | :: ↓PCR産物を電気泳動にかけた | ||
| + | |||
| + | :<TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD>テンプレートDNA</TD><TD>各0.5μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>10×PCR Buffer for KOD-Plus-</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>2mM d NTPs</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>2mM MgSO₄</TD><TD>4μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>MilliQ</TD><TD>33μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | :</TABLE> | ||
| + | |||
| + | :<TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD COLSPAN="2">(ahpC,OxyR)</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>62.2℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>1min</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD></TD><TD COLSPAN="3"><CENTER>30サイクル</CENTER></TD><TD></TD><TD></TD></TR> | ||
| + | :</TABLE> | ||
| + | |||
| + | :<TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD COLSPAN="2">(hemH,dps)</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>60℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>33sec</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR> | ||
| + | :</TABLE> | ||
| + | |||
| + | 【実験結果】 | ||
| + | |||
| + | :(1)<TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD COLSPAN="2">吸光度測定結果</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD ROWSPAN="5"></TD><TD>0.059</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD>0.055</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD>0.062</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD>0.059</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD>0.070</TD></TR> | ||
| + | :<TR><TD>平均</TD><TD>0.061</TD></TR> | ||
| + | :</TABLE> | ||
| + | ::この値から計算して、 | ||
| + | ::DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml) | ||
| + | |||
| + | ::電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された | ||
| + | |||
| + | (2) PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した | ||
Revision as of 06:47, 14 September 2010
August 29
【時間】
- 9:00～
【実験担当】
- 岩城,古道,竹内,中村,臼井
【実験目的】
- (1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
【実験内容】
- (1) pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
- 前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した
- ↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心５分（20℃、14500rpm）
- ↓上清をカラムに加えた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓20℃、14500rpmで1分間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓20℃、14500rpmで30秒間遠心を行った
- ↓溶出液を回収
- ↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
- Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた
- ↓下に示したプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR産物を電気泳動にかけた
テンプレートDNA 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO₄ 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL
(ahpC,OxyR) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル
(hemH,dps) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 33sec 2min 保持 30サイクル
【実験結果】
- (1)
吸光度測定結果 0.059 0.055 0.062 0.059 0.070 平均 0.061 - この値から計算して、
- DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)
- 電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された
(2) PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
