Template:KIT-Kyoto-Augsut29

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)

Latest revision as of 11:38, 25 October 2010

August 29

>>top

Time

9:00～

Member

岩城,古道,竹内,中村,臼井

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui

Purpose

DNA miniprep , agarose gel electrophoresis and density measurement of pSB6A1(K121013).[Furumichi]
PCR of hemH,ahpC,dps and OxyR.[Furumichi]
Confirm SufA and OxyR by agarose gel electrophoresis.[Iwaki]
DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Takeuchi]

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定　[古道]

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR　[古道]

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認　[岩城]

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep　[竹内]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定

　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った

　↓溶出液を回収

　↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

テンプレートDNA	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

(ahpC,OxyR)
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	62.2℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

(hemH,dps)
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	33sec	2min	保持
	30サイクル

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認

　PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った

　1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep

　カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した

　前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml

　↓R3を4 ml加えてボルテックスした

　↓L7を4 ml加えて5 min放置した

　↓N3を4 ml加えた

　↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した

　↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた

　↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した

　↓カラムにE4を5 ml加えた

　↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた

　↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した

　↓70 %エタノールを3 ml加えた

　↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した

　↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた

　↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した

Results

(1)

吸光度測定結果
	0.059
	0.055
	0.062
	0.059
	0.070
平均	0.061

この値から計算して、

DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)

電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された

(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した

(3)　SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた

　OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した

(4)　冷蔵庫で保管した

@@ Line 1: / Line 1: @@
 == August 29 ==
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
-【時間】
+'''Time'''
 :9:00～
-【実験担当】
+'''Member'''
 :岩城,古道,竹内,中村,臼井
+:Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui
+'''Purpose'''
+:# DNA miniprep , agarose gel electrophoresis and density measurement of pSB6A1(K121013).[Furumichi]
+:# PCR of hemH,ahpC,dps and OxyR.[Furumichi]
+:# Confirm SufA and OxyR by agarose gel electrophoresis.[Iwaki]
+:# DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Takeuchi]
+:(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定　[古道]
+:(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR　[古道]
+:(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認　[岩城]
+:(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep　[竹内]
-【実験目的】
-:(1)　pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
-:(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
-【実験内容】
+'''Method'''
-:(1)　pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
+:(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
-::　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した
+::　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した
-::　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌した
+::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した
 ::　↓上清を捨てた
 ::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 ::　↓SolutionⅢを350μl加えた
-::　↓遠心５分（20℃、14500rpm）
+::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 ::　↓上清をカラムに加えた
-::　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ::　↓抽出液を捨てた
 ::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
-::　↓20℃、14500rpmで1分間遠心した
+::　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
 ::　↓抽出液を捨てた
 ::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
-::　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ::　↓抽出液を捨てた
-::　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 ::　↓抽出液を捨てた
 ::　↓滅菌水をカラムに入れた
-::　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心を行った
+::　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った
 ::　↓溶出液を回収
 ::　↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った
@@ Line 51: / Line 59: @@
 :<TD>2mM d NTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
 :<TR>
-:<TD>2mM MgSO₄</TD><TD>4μL</TD></TR>
+:<TD>2mM MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
 :<TR>
 :<TD>MilliQ</TD><TD>33μL</TD></TR>
@@ Line 58: / Line 66: @@
 :</TABLE>
-:<TABLE BORDER="1"><TR>
+:<TABLE BORDER="0"><TR>
+:<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 :<TD COLSPAN="2">(ahpC,OxyR)</TD></TR>
 :<TR>
@@ Line 68: / Line 77: @@
 :<TR>
 :<TD></TD><TD COLSPAN="3"><CENTER>30サイクル</CENTER></TD><TD></TD><TD></TD></TR>
-:</TABLE>
+:</TABLE></TD>
+:<TD></TD><TD></TD>
-:<TABLE BORDER="1"><TR>
+:<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 :<TD COLSPAN="2">(hemH,dps)</TD></TR>
 :<TR>
@@ Line 79: / Line 88: @@
 :<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>33sec</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR>
 :<TR>
-:<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
+:<TD></TD><TD COLSPAN="3"><CENTER>30サイクル</CENTER></TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 :</TABLE>
+:</TD></TR></TABLE>
+:(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認
+::　PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った
+::　1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した
+:(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep
+::　カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した
+::　前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml
+::　↓R3を4 ml加えてボルテックスした
+::　↓L7を4 ml加えて5 min放置した
+::　↓N3を4 ml加えた
+::　↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した
+::　↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた
+::　↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した
+::　↓カラムにE4を5 ml加えた
+::　↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた
+::　↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した
+::　↓70 %エタノールを3 ml加えた
+::　↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した
+::　↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた
+::　↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した
-【実験結果】
+'''Results'''
-:(1)<TABLE BORDER="1"><TR>
+:(1)
+:<TABLE BORDER="0"><TR>
+:<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 :<TD COLSPAN="2">吸光度測定結果</TD></TR>
 :<TR><TD ROWSPAN="5"></TD><TD>0.059</TD></TR>
@@ Line 92: / Line 123: @@
 :<TR><TD>0.070</TD></TR>
 :<TR><TD>平均</TD><TD>0.061</TD></TR>
-:</TABLE>
+:</TABLE></TD>
-::この値から計算して、
+:<TD></TD><TD></TD>
-::DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)
+:<TD VALIGN="top"><TABLE BORDER="0"><TR>
+:<TD><BR><BR>
-::電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された
+:この値から計算して、<BR>
+:DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)<BR>
+:<BR>
+:電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された<BR>
+:</TD></TR></TABLE>
+:</TD></TR></TABLE>
-(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
+:(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
+:(3)　SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた
+:   　OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した
+:(4)　冷蔵庫で保管した