"
Template:KIT-Kyoto-Augsut28
From 2010.igem.org
August 28
【時間】
- 9:00～
【実験担当】
- 岩城,竹内,中村,臼井,革島
【実験目的】
- (1) AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成
- (2) AcrAB,oxyRのPCR
- (3) dps,hemHのPCR
- (4) dps,hemHの電気泳動
- (5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
- (6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動
【実験内容】
- (1) Primer MIXの作成
- AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
- 全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
- (2) AcrAB,oxyRのPCR
＜PCR試薬組成＞ AcrAB oxyR PrimerF 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL
- ＜設定＞
- Pre Denature・・・94℃、2min
- 35Cycles↓
- Denature・・・・・・・・94℃、15sec
- Annealing・・・・・・・62.8℃、30sec
- Extension・・・・・・・68℃、30sec
- +Extension・・・・・・・68℃、2min
- 4℃、∞
- (3) dps,hemHのPCR
＜PCR試薬組成＞ dps hemH PrimerF 1.5μL 1.5μL </TR>dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 0.5μL 0.5μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL
- ＜設定＞
- Pre Denature・・・94℃、2min
- 35Cycles↓
- Denature・・・・・・・・94.0℃、15sec
- Annealing・・・・・・・60.0℃、30sec
- Extension・・・・・・・68.0℃、30sec
- +Extension・・・・・・・68.0℃、2min
4℃、 ∞
- (4) dps,hemHの電気泳動
- (3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
- 諸条件を以下に示す
- ＜条件＞
- DNA量 5μL
- 電気泳動 100V 30min
- EtBr処理 20min
- (5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）について同様の操作を行った
培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した。
↓
4℃、14,000rpm、5min遠心
↓
上澄みをデカンテーションで取り除いた
↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
↓
SolutionⅡ200μLを加え混合
↓
5min on ice
↓
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
↓
5min on ice
↓
4℃、14,000rpm、10min遠心
↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
↓
4℃、14,000rpm、20min遠心
↓
70％EtOHを200μL加える
↓
4℃、14,000rpm、10min遠心
↓
30sec 遠心乾燥
↓
TE30μL加えてプラスミドDNAとした
(6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした
（条件） DNA量 5μL 電気泳動 100V 20min EtBr処理 20min 【実験結果】 (1)今回作成したPMは今後使用していく予定
(2)後日電気泳動により増幅の確認を行う
(3,4)hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）共に明瞭なバンドが確認された ＊詳細は写真参照 【考察】 (3，4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(ｌ)で培養
