Template:KIT-Kyoto-Augsut28

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(→Augsut 28)
(→No title)
Line 1: Line 1:
== August 28 ==
== August 28 ==
-
=== No title ===
+
【時間】
 +
:9:00～
 +
 
 +
【実験担当】
 +
:岩城,竹内,中村,臼井,革島
 +
 +
【実験目的】
 +
:(1)　AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成
 +
:(2)　AcrAB,oxyRのPCR
 +
:(3)　dps,hemHのPCR
 +
:(4)　dps,hemHの電気泳動
 +
:(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
 +
:(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動
 +
 +
【実験内容】
 +
:(1)　Primer MIXの作成
 +
::　AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
 +
::　全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
 +
 
 +
:(2)　AcrAB,oxyRのPCR
 +
:<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
:<TD>＜PCR試薬組成＞</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD></TD><TD>AcrAB</TD><TD>oxyR</TD></TR> 
 +
:<TR>
 +
:<TD>PrimerF</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>KOD-Plus- Buffer</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>テンプレートDNA(DH5α)</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>MgSO4</TD><TD>4μL</TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>H2O</TD><TD>33μL</TD><TD>33μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>total</TD><TD>50μL</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
 
 +
:＜設定＞
 +
::Pre　Denature・・・94℃、2min
 +
::35Cycles↓
 +
::　Denature・・・・・・・・94℃、15sec
 +
::　Annealing・・・・・・・62.8℃、30sec
 +
::　Extension・・・・・・・68℃、30sec
 +
 
 +
::+Extension・・・・・・・68℃、2min　　　　　　　　　　　　
 +
::　　　　　　　　　　　　　        4℃、∞
 +
 
 +
:(3)　dps,hemHのPCR
 +
:<TABLE BORDER="1">
 +
:<TR>
 +
:<TD>＜PCR試薬組成＞</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD></TD><TD>dps</TD><TD>hemH</TD></TR>
 +
:<TD>PrimerF</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>KOD-Plus- Buffer</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>テンプレートDNA(DH5α)</TD><TD>0.5μL</TD><TD>0.5μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>MgSO4</TD><TD>4μL</TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>H2O</TD><TD>33μL</TD><TD>33μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>total</TD><TD>50μL</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
 
 +
:＜設定＞
 +
::Pre　Denature・・・94℃、2min
 +
::35Cycles↓
 +
::　Denature・・・・・・・・94.0℃、15sec
 +
::　Annealing・・・・・・・60.0℃、30sec
 +
::　Extension・・・・・・・68.0℃、30sec
 +
::+Extension・・・・・・・68.0℃、2min　　　　　　　　　　　　
 +
　　　　　　　        　　　　　　　　　4℃、　∞
 +
:(4)　dps,hemHの電気泳動　
 +
::　(3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
 +
::　諸条件を以下に示す
 +
:＜条件＞
 +
::　DNA量　　5μL
 +
::　電気泳動　100V　30min
 +
::　EtBr処理　20min
 +
 
 +
:(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
 +
　pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）について同様の操作を行った
 +
 +
培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した。
 +
 
 +
　↓
 +
 
 +
4℃、14,000rpm、5min遠心
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
上澄みをデカンテーションで取り除いた
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
SolutionⅡ200μLを加え混合
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
5min on ice
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
5min on ice
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
4℃、14,000rpm、10min遠心
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
4℃、14,000rpm、20min遠心
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
70％EtOHを200μL加える
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
4℃、14,000rpm、10min遠心
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
30sec　遠心乾燥
 +
 
 +
　　↓
 +
 
 +
TE30μL加えてプラスミドDNAとした
 +
 
 +
(6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした
 +
（条件）　　DNA量　　　　5μL
 +
　　　　　　電気泳動　　　100V　20min
 +
　　　　　　EtBr処理　　　20min
 +
【実験結果】
 +
(1)今回作成したPMは今後使用していく予定
 +
 +
(2)後日電気泳動により増幅の確認を行う
 +
 +
(3,4)hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
 +
 +
(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）共に明瞭なバンドが確認された
 +
＊詳細は写真参照
 +
【考察】
 +
(3，4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
 +
 +
(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(ｌ)で培養

Revision as of 05:22, 14 September 2010

August 28

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城,竹内,中村,臼井,革島

【実験目的】

(1)　AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成
(2)　AcrAB,oxyRのPCR
(3)　dps,hemHのPCR
(4)　dps,hemHの電気泳動
(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動

【実験内容】

(1)　Primer MIXの作成
　AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
　全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
(2)　AcrAB,oxyRのPCR
＜PCR試薬組成＞
AcrABoxyR
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)1μL1μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
＜設定＞
Pre　Denature・・・94℃、2min
35Cycles↓
　Denature・・・・・・・・94℃、15sec
　Annealing・・・・・・・62.8℃、30sec
　Extension・・・・・・・68℃、30sec
+Extension・・・・・・・68℃、2min　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　 4℃、∞
(3)　dps,hemHのPCR
</TR>
＜PCR試薬組成＞
dpshemH
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)0.5μL0.5μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
＜設定＞
Pre　Denature・・・94℃、2min
35Cycles↓
　Denature・・・・・・・・94.0℃、15sec
　Annealing・・・・・・・60.0℃、30sec
　Extension・・・・・・・68.0℃、30sec
+Extension・・・・・・・68.0℃、2min　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　 　　　　　　　　　4℃、　∞

(4)　dps,hemHの電気泳動　
　(3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
　諸条件を以下に示す
＜条件＞
　DNA量　　5μL
　電気泳動　100V　30min
　EtBr処理　20min
(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ

　pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）について同様の操作を行った

培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した。 

　↓

4℃、14,000rpm、5min遠心

　　↓

上澄みをデカンテーションで取り除いた

　　↓

菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)

　　↓

SolutionⅡ200μLを加え混合

　　↓

5min on ice

　　↓

SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)

　　↓

5min on ice

　　↓

4℃、14,000rpm、10min遠心

　　↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　　↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　　↓

4℃、14,000rpm、20min遠心

　　↓

70％EtOHを200μL加える

　　↓

4℃、14,000rpm、10min遠心

　　↓

30sec　遠心乾燥

　　↓

TE30μL加えてプラスミドDNAとした 

(6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした

（条件）　　DNA量　　　　5μL 　　　　　　電気泳動　　　100V　20min 　　　　　　EtBr処理　　　20min 【実験結果】 (1)今回作成したPMは今後使用していく予定

(2)後日電気泳動により増幅の確認を行う

(3,4)hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された

(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）共に明瞭なバンドが確認された ＊詳細は写真参照 【考察】 (3，4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う

(5,6)pSB1A2 （E0420）、pSB1A2（I13522）のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(ｌ)で培養

Retrieved from "http://2010.igem.org/Template:KIT-Kyoto-Augsut28"