Template:KIT-Kyoto-Augsut27

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August 27

Time

9:00~

Member

福山,竹内,臼井
Fukuyama,Takeuchi,Usui

Purpose

(1) psB6A1(K121013)のミニプレ [竹内]
(2) エチジウムブロマイドの作成

Method

(1) psB6A1(K121013)のミニプレ
 psB6A1(K121013)24mL分を分注した
 ↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μl加えた
 ↓SolutionⅢを350μl加えた
 ↓遠心5分(20℃、14500rpm)
 ↓上清をカラムに入れた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 ↓遠心1分(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓滅菌水をカラムに入れた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓溶出液を回収
 ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
 ↓遠心10分(4℃、14000rpm)
 ↓上清をすて、70%エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
 ↓遠心5分(4℃、14000rpm)
 ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
 ↓MilliQを30μl加えた
 ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
  Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
  (マーカーは1kbp radderを使用した)
  ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
  ↓泳動結果を写真で撮影した
(2) エチジウムブロマイドの作成
MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた

Results

(1) 十分に濃いバンドが確認できた
これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
(2) 1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった

Consideration

(1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
(2) これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる