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-	=== No title ===	+	【時間】　9:00～
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		+	【実験担当】福山,竹内,臼井
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		+	【実験目的】
		+	(1)K121013(on psB6A1)のミニプレ
		+	(2)エチジウムブロマイドの作成
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		+	【実験内容】
		+	(1)
		+	K121013(on psB6A1)24mL分を分注した。
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		+	遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌し、エッペン２本分にした
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		+	上清を捨てた
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		+	SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
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		+	SolutionⅡを250μl加えた
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		+	SolutionⅢを350μl加えた
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		+	遠心５分（20℃、14500rpm）
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		+	上清をカラムに入れた
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		+	遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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		+	抽出液を捨てた
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		+	SolutionⅣを500μlカラムに加えた
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		+	遠心1分（20℃、14500rpm）
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		+	抽出液を捨てた
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		+	SolutionⅤを700μlカラムに加えた
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		+	遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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		+	抽出液を捨てた
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		+	遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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		+	抽出液を捨てた
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		+	滅菌水をカラムに入れた
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		+	遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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		+	溶出液を回収
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		+	酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、
		+
		+	それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
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		+	↓
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		+	遠心１０分（4℃、14000rpm）
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		+	上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
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		+	遠心5分（4℃、14000rpm）
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		+	上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
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		+	↓
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		+	MilliQを30μl加えた
		+	↓
		+	二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した。
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		+	Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
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		+	(マーカーは1kbp radderを使用した)
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		+	↓
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		+	100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
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		+	↓
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		+	泳動結果を写真で撮影した
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		+	（２）
		+	MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液（0.44mg/mL）を１滴加えた。
		+
		+	【実験結果】
		+	(１)十分に濃いバンドが確認できた
		+	これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
		+	次回からは１００倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
		+
		+	(２)
		+	１滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに３滴付加したところ十分に使用できるようになった
		+	これより40mL分を作る時は少なくとも４滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる

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Revision as of 03:37, 14 September 2010

August 27

【時間】　9:00～

【実験担当】福山,竹内,臼井

【実験目的】 (1)K121013(on psB6A1)のミニプレ (2)エチジウムブロマイドの作成

【実験内容】 (1) K121013(on psB6A1)24mL分を分注した。

↓

遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌し、エッペン２本分にした

↓

上清を捨てた

↓

SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

↓

SolutionⅡを250μl加えた

↓

SolutionⅢを350μl加えた

↓

遠心５分（20℃、14500rpm）

↓

上清をカラムに入れた

↓

遠心３０秒（20℃、14500rpm）

↓

抽出液を捨てた

↓

SolutionⅣを500μlカラムに加えた

↓

遠心1分（20℃、14500rpm）

↓

抽出液を捨てた

↓

SolutionⅤを700μlカラムに加えた

↓

遠心３０秒（20℃、14500rpm）

↓

抽出液を捨てた

↓

遠心３０秒（20℃、14500rpm）

↓

抽出液を捨てた

↓

滅菌水をカラムに入れた

↓

遠心３０秒（20℃、14500rpm）

↓

溶出液を回収

↓

酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、

それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

↓

遠心１０分（4℃、14000rpm）

↓

上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。

↓

遠心5分（4℃、14000rpm）

↓

上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

↓

MilliQを30μl加えた ↓ 二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した。

Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した

(マーカーは1kbp radderを使用した)

　　　　　　　　↓

100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

　　　　　　　　↓

泳動結果を写真で撮影した

（２） MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液（0.44mg/mL）を１滴加えた。

【実験結果】 (１)十分に濃いバンドが確認できた これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる 次回からは１００倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき

(２) １滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに３滴付加したところ十分に使用できるようになった これより40mL分を作る時は少なくとも４滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる