Template:KIT-Kyoto-Augsut19

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:(3)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0420）のミディプレ
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:(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う
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:(1)　pSB1A2(I13522）とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
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::　-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解
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::　↓ 各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
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:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク
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:: ↓37℃でインキュベート　
:: ↓37℃でインキュベート　
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:(3)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0420）のミディプレ（18日の続き）
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::　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
::　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
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Revision as of 11:05, 3 October 2010

Augsut 19

>>top

Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Title

(1)　pSB1A2(I13522）とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク　[中村]
(3)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0420）のミディプレ(18日の続き)　[中村]
(4)　プロモーター（PoxyR、acrAB）のPCRと電気泳動　[竹内]
(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)　[古道]

Purpose

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のシングルコロニーを得る
(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
(4)　プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う

Method

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
　↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
　↓on　ice　30min
　↓45℃で45sec、ヒートショック
　↓on　ice　2min
　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
　↓37℃で1h、振とう培養
　↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク
　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした
↓37℃でインキュベート　
(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した
　↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した
　↓この吸光度を計測した
(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
　PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
＜組成＞
PrimerF各1.5μL
PrimerR各1.5μL
テンプレートDNA
(DH5α、JM109)		1μL
Buffer for KOD-Plus5μL
2mM dNTPs5μL
2mM MgSO42μL
KOD-Plus(1U/μL)1μL
MilliQ33μL
＜設定＞
Pre　Denature94℃2min
Denature94℃15sec
Annealing62.8℃30sec
Extension68℃20sec
4℃∞
　PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
　　　　DNA量　5μL
　　　　Loading Buffer　1μL
　の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した
(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
　前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、
　0.9と理想の数値O.D＝0.4～0.8からはずれていたので、
　全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した
　↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、
　　全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた
　↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った
　↓遠心管に移して氷上10分間放置した
　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した
　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した
　↓1.5mlのDMSO(7％)を加え氷上で10分間放置した
　↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ
　↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った
　↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、
　　作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた
　↓15分間氷上に放置した
　↓42℃で40秒間熱ショックを与えた
　↓10分間氷上に放置した
　↓4℃で保存した
　↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた
　↓37℃で一晩インキュベートした

Result

(1)　十分な数のコロニーを確認できた
(2)　シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた
(3)　濁度を測定した結果を以下の表にまとめた
pSB1A2pSB1C3
1回目0.1040.051
2回目0.1030.033
3回目0.1200.046
4回目0.1150.052
5回目0.1220.030
平均0.1130.0424
 これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである

この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(4)　PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった
これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる
後日、Extensionが不十分であったことも判明した
(5)　形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した
20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する
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