Template:KIT-Kyoto-Augsut19

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(→No title)
(→No title)
Line 1: Line 1:
== Augsut 19 ==
== Augsut 19 ==
-
=== No title ===
+
【時間】
-
【時間】　9:00～<BR>
+
:9:00～
-
【実験担当】岩城、古道、竹内、中村<BR>
+
【実験担当】
-
+
:岩城、古道、竹内、中村
-
【実験名】<BR>
+
 
-
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション<BR>
+
【実験名】
-
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク<BR>
+
:(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
-
(3)pSB1C1（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ（18日の続き）<BR>
+
:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
-
(4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動<BR>
+
:(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ(18日の続き)
-
+
:(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
-
【実験目的】<BR>
+
:(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
-
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション<BR>
+
 
-
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る<BR>
+
【実験目的】
-
(3) pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ<BR>
+
:(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
-
(4)プロモーター（PoxyR、acrAB）を増やし、それを確認する<BR>
+
:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
-
【実験内容】<BR>
+
:(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
-
(1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解<BR>
+
:(4)　プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
:(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う
-
　　DH5α100μLに対し、l13522[2-（8A）]及び、R0040（1-6I）各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合<BR>
+
 
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
【実験内容】
-
　　on　ice　30min<BR>
+
:(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
::　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
-
　　45℃で45sec、ヒートショック<BR>
+
::　↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
::　↓on　ice　30min
-
　　on　ice　2min<BR>
+
::　↓45℃で45sec、ヒートショック
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
::　↓on　ice　2min
-
　　各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた<BR>
+
::　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
::　↓37℃で1時間振とう培養
-
　　37℃で1h、振とう培養<BR>
+
::　↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight
-
　　　　　　　　　　↓ <BR>
+
 
-
　　培養後、全量をLBプレート（+amp）に撒き、37℃でOvernight<BR>
+
:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
-
+
::　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれLBプレート(+amp)にストリークした
-
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート（+amp）に白金耳を用いて、ストリークした。<BR>
+
::　↓37℃でインキュベートした
-
　　　　　　　  　  　　      ↓<BR>
+
 
-
　　37℃でインキュベート　<BR>
+
:(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
-
+
::　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
-
(3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた<BR>
+
::　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
-
　　　　　　　　　　　　↓<BR>
+
::　↓遠心後、上清を捨てた
-
　　15,000×g、4℃、30min　遠心<BR>
+
::　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した
-
　　　　　　　　　　　　↓<BR>
+
::　↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した
-
　　遠心後、上清を捨てた<BR>
+
::　↓この吸光度を計測した
-
　　　　　　　　　　　　↓<BR>
+
 
-
　　37℃でインキュベートし、適度に乾燥（乾かしすぎない！）<BR>
+
:(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
-
　　　　　　　　　　　　↓<BR>
+
::　PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
-
　　TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵<BR>
+
::<TABLE BORDER="0"><TR>
-
　　　　　　　　　　　　↓<BR>
+
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-
　　これの吸光度を計測した<BR>
+
::<TD>＜組成＞</TD></TR>
-
+
::<TR>
-
(4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った<BR>
+
::<TD>PrimerF</TD><TD>各1.5μL</TD></TR>
-
(組成)<BR>
+
::<TR>
-
PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL<BR>
+
::<TD>PrimerR</TD><TD>各1.5μL</TD></TR>
-
PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL<BR>
+
::<TR>
-
テンプレートDNA（DH5α、JM109）・・・・・・1μL<BR>
+
::<TD>テンプレートDNA<BR>(DH5α、JM109)</TD><TD>1μL</TD></TR>
-
Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL<BR>
+
::<TR>
-
2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL<BR>
+
::<TD>Buffer for KOD-Plus</TD><TD>5μL</TD></TR>
-
2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL<BR>
+
::<TR>
-
KOD-Plus（1U/μL）・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL<BR>
+
::<TD>2mM dNTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
-
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL<BR>
+
::<TR>
-
+
::<TD>2mM MgSO4</TD><TD>2μL</TD></TR>
-
(設定)<BR>
+
::<TR>
-
Pre　Denature・・・94℃、2min<BR>
+
::<TD>KOD-Plus(1U/μL)</TD><TD>1μL</TD></TR>
-
Denature・・・・・・・94℃、15sec<BR>
+
::<TR>
-
Annealing・・・・・・62.8℃、30sec<BR>
+
::<TD>MilliQ</TD><TD>33μL</TD></TR>
-
Extension・・・・・・68℃、20sec<BR>
+
::</TABLE></TD>
-
　　　　　　　　　　　　4℃、∞<BR>
+
::<TD></TD><TD></TD>
-
+
::<TD VALIGN="top"><TABLE BORDER="1"><TR>
-
PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした<BR>
+
::<TD>＜設定＞</TD></TR>
-
+
::<TR>
-
DNA量・・・・・・・・・・・5μL<BR>
+
::<TD>Pre　Denature</TD><TD>94℃</TD><TD>2min</TD></TR>
-
Loading Buffer・・・・1μL<BR>
+
::<TR>
-
の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した<BR>
+
::<TD>Denature</TD><TD>94℃</TD><TD>15sec</TD></TR>
-
+
::<TR>
-
【実験結果】<BR>
+
::<TD>Annealing</TD><TD>62.8℃</TD><TD>30sec</TD></TR>
-
(3)吸光度の結果<BR>
+
::<TR>
-
　　　　　pSB6　　　　pSB1C3<BR>
+
::<TD>Extension</TD><TD>68℃</TD><TD>20sec</TD></TR>
-
1回目　  1.132　　　　0.155<BR>
+
::<TR>
-
2回目　  0.994　　　 0.138<BR>
+
::<TD></TD><TD>4℃</TD><TD>∞</TD></TR>
-
3回目　  0.984　　　 0.126<BR>
+
::</TABLE>
-
4回目　  0.990　　　 0.122<BR>
+
::</TD></TR></TABLE>
-
5回目　  0.975　　　 0.125<BR>
+
 
-
平均　　 1.015　　　  0.1332<BR>
+
::　PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
-
＊DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定<BR>
+
::　　　　DNA量　5μL
-
+
::　　　　Loading Buffer　1μL
-
(4)写真参照<BR>
+
::　の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した
 +
 
 +
:(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
 +
::　前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、
 +
::　0.9と理想の数値O.D＝0.4～0.8からはずれていたので、
 +
::　全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した
 +
::　↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、
 +
::　　全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた
 +
::　↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った
 +
::　↓遠心管に移して氷上10分間放置した
 +
::　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
 +
::　↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した
 +
::　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
 +
::　↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した
 +
::　↓1.5mlのDMSO(7％)を加え氷上で10分間放置した
 +
::　↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ
 +
::　↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った
 +
::　↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、
 +
::　　作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた
 +
::　↓15分間氷上に放置した
 +
::　↓42℃で40秒間熱ショックを与えた
 +
::　↓10分間氷上に放置した
 +
::　↓4℃で保存した
 +
::　↓アンピシリン入りのLBプレートに全量播いた
 +
::　↓37℃で一晩インキュベートした
 +
 
 +
【実験結果】
 +
:(1)　十分な数のコロニーを確認できた
 +
:(2)　シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた
 +
:(3)　濁度を測定した結果を以下の表にまとめた
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD></TD><TD>pSB1A2</TD><TD>pSB1C3</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1回目</TD><TD>0.104</TD><TD>0.051</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2回目</TD><TD>0.103</TD><TD>0.033</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>3回目</TD><TD>0.120</TD><TD>0.046</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>4回目</TD><TD>0.115</TD><TD>0.052</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>5回目</TD><TD>0.122</TD><TD>0.030</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>平均</TD><TD>0.113</TD><TD>0.0424</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD VALIGN="bottom">これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである<BR>
 +
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した<BR>
 +
<BR>
 +
これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである<BR>
 +
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した<BR>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 
 +
:(4)　PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった
 +
::これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる
 +
::後日、Extensionが不十分であったことも判明した
 +
 
 +
:(5)　形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した
 +
::20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する

Revision as of 07:03, 16 September 2010

Augsut 19

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城、古道、竹内、中村

【実験名】

(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ(18日の続き)
(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)

【実験目的】

(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
(4)　プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う

【実験内容】

(1)　l13522[2-(8A)]とR0040(1-6I)のトランスフォーメーション
　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
　↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
　↓on　ice　30min
　↓45℃で45sec、ヒートショック
　↓on　ice　2min
　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
　↓37℃で1時間振とう培養
　↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight
(2)　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
　BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれLBプレート(+amp)にストリークした
　↓37℃でインキュベートした
(3)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した
　↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した
　↓この吸光度を計測した
(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
　PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
＜組成＞
PrimerF各1.5μL
PrimerR各1.5μL
テンプレートDNA
(DH5α、JM109)		1μL
Buffer for KOD-Plus5μL
2mM dNTPs5μL
2mM MgSO42μL
KOD-Plus(1U/μL)1μL
MilliQ33μL
＜設定＞
Pre　Denature94℃2min
Denature94℃15sec
Annealing62.8℃30sec
Extension68℃20sec
4℃∞
　PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
　　　　DNA量　5μL
　　　　Loading Buffer　1μL
　の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した
(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
　前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、
　0.9と理想の数値O.D＝0.4～0.8からはずれていたので、
　全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した
　↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、
　　全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた
　↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った
　↓遠心管に移して氷上10分間放置した
　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した
　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した
　↓1.5mlのDMSO(7％)を加え氷上で10分間放置した
　↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ
　↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った
　↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、
　　作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた
　↓15分間氷上に放置した
　↓42℃で40秒間熱ショックを与えた
　↓10分間氷上に放置した
　↓4℃で保存した
　↓アンピシリン入りのLBプレートに全量播いた
　↓37℃で一晩インキュベートした

【実験結果】

(1)　十分な数のコロニーを確認できた
(2)　シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた
(3)　濁度を測定した結果を以下の表にまとめた
pSB1A2pSB1C3
1回目0.1040.051
2回目0.1030.033
3回目0.1200.046
4回目0.1150.052
5回目0.1220.030
平均0.1130.0424
 これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである

この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(4)　PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった
これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる
後日、Extensionが不十分であったことも判明した
(5)　形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した
20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する
Retrieved from "http://2010.igem.org/Template:KIT-Kyoto-Augsut19"