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Template:KIT-Kyoto-Augsut19
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| + | 【時間】 9:00～<BR> | ||
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| + | 【実験担当】岩城、古道、竹内、中村<BR> | ||
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| + | 【実験名】<BR> | ||
| + | (1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション<BR> | ||
| + | (2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク<BR> | ||
| + | (3)pSB1C1（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ（18日の続き）<BR> | ||
| + | (4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動<BR> | ||
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| + | 【実験目的】<BR> | ||
| + | (1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション<BR> | ||
| + | (2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る<BR> | ||
| + | (3) pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ<BR> | ||
| + | (4)プロモーター（PoxyR、acrAB）を増やし、それを確認する<BR> | ||
| + | 【実験内容】<BR> | ||
| + | (1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解<BR> | ||
| + | ↓ <BR> | ||
| + | DH5α100μLに対し、l13522[2-（8A）]及び、R0040（1-6I）各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合<BR> | ||
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| + | on ice 30min<BR> | ||
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| + | 45℃で45sec、ヒートショック<BR> | ||
| + | ↓ <BR> | ||
| + | on ice 2min<BR> | ||
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| + | 各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた<BR> | ||
| + | ↓ <BR> | ||
| + | 37℃で1h、振とう培養<BR> | ||
| + | ↓ <BR> | ||
| + | 培養後、全量をLBプレート（+amp）に撒き、37℃でOvernight<BR> | ||
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| + | (2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート（+amp）に白金耳を用いて、ストリークした。<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | 37℃でインキュベート <BR> | ||
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| + | (3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | 15,000×g、4℃、30min 遠心<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | 遠心後、上清を捨てた<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | 37℃でインキュベートし、適度に乾燥（乾かしすぎない！）<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵<BR> | ||
| + | ↓<BR> | ||
| + | これの吸光度を計測した<BR> | ||
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| + | (4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った<BR> | ||
| + | (組成)<BR> | ||
| + | PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL<BR> | ||
| + | PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL<BR> | ||
| + | テンプレートDNA（DH5α、JM109）・・・・・・1μL<BR> | ||
| + | Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL<BR> | ||
| + | 2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL<BR> | ||
| + | 2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL<BR> | ||
| + | KOD-Plus（1U/μL）・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL<BR> | ||
| + | MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL<BR> | ||
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| + | (設定)<BR> | ||
| + | Pre Denature・・・94℃、2min<BR> | ||
| + | Denature・・・・・・・94℃、15sec<BR> | ||
| + | Annealing・・・・・・62.8℃、30sec<BR> | ||
| + | Extension・・・・・・68℃、20sec<BR> | ||
| + | 4℃、∞<BR> | ||
| + | |||
| + | PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした<BR> | ||
| + | |||
| + | DNA量・・・・・・・・・・・5μL<BR> | ||
| + | Loading Buffer・・・・1μL<BR> | ||
| + | の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した<BR> | ||
| + | |||
| + | 【実験結果】<BR> | ||
| + | (3)吸光度の結果<BR> | ||
| + | pSB6 pSB1C3<BR> | ||
| + | 1回目 1.132 0.155<BR> | ||
| + | 2回目 0.994 0.138<BR> | ||
| + | 3回目 0.984 0.126<BR> | ||
| + | 4回目 0.990 0.122<BR> | ||
| + | 5回目 0.975 0.125<BR> | ||
| + | 平均 1.015 0.1332<BR> | ||
| + | ＊DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定<BR> | ||
| + | |||
| + | (4)写真参照<BR> | ||
Revision as of 02:29, 8 September 2010
Augsut 19
No title
【時間】 9:00～
【実験担当】岩城、古道、竹内、中村
【実験名】
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
(3)pSB1C1（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ（18日の続き）
(4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
【実験目的】
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
(3) pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
(4)プロモーター（PoxyR、acrAB）を増やし、それを確認する
【実験内容】
(1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解
↓
DH5α100μLに対し、l13522[2-（8A）]及び、R0040（1-6I）各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
↓
on ice 30min
↓
45℃で45sec、ヒートショック
↓
on ice 2min
↓
各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
↓
37℃で1h、振とう培養
↓
培養後、全量をLBプレート（+amp）に撒き、37℃でOvernight
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート（+amp）に白金耳を用いて、ストリークした。
↓
37℃でインキュベート
(3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた
↓
15,000×g、4℃、30min 遠心
↓
遠心後、上清を捨てた
↓
37℃でインキュベートし、適度に乾燥（乾かしすぎない！）
↓
TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵
↓
これの吸光度を計測した
(4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
(組成)
PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
テンプレートDNA（DH5α、JM109）・・・・・・1μL
Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL
KOD-Plus（1U/μL）・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL
(設定)
Pre Denature・・・94℃、2min
Denature・・・・・・・94℃、15sec
Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
Extension・・・・・・68℃、20sec
4℃、∞
PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
DNA量・・・・・・・・・・・5μL
Loading Buffer・・・・1μL
の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した
【実験結果】
(3)吸光度の結果
pSB6 pSB1C3
1回目 1.132 0.155
2回目 0.994 0.138
3回目 0.984 0.126
4回目 0.990 0.122
5回目 0.975 0.125
平均 1.015 0.1332
＊DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定
(4)写真参照
