Template:KIT-Kyoto-Augsut19
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+ | :: ↓遠心管に移して氷上10分間放置した | ||
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+ | :: ↓1.5mlのDMSO(7%)を加え氷上で10分間放置した | ||
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+ | :: ↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った | ||
+ | :: ↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、 | ||
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+ | :: ↓15分間氷上に放置した | ||
+ | :: ↓42℃で40秒間熱ショックを与えた | ||
+ | :: ↓10分間氷上に放置した | ||
+ | :: ↓4℃で保存した | ||
+ | :: ↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた | ||
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+ | '''Result''' | ||
+ | :(1) 十分な数のコロニーを確認できた | ||
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+ | ::後日、Extensionが不十分であったことも判明した | ||
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+ | :(5) 形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した | ||
+ | ::20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する |
Latest revision as of 10:34, 25 October 2010
Augsut 19
Time
- 9:00~
Member
- 岩城、古道、竹内、中村
- Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
Title
- (1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク [中村]
- (3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ(18日の続き) [中村]
- (4) プロモーター(PoxyR、acrAB)のPCRと電気泳動 [竹内]
- (5) コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き) [古道]
Purpose
- Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells.[Nakamura]
- Picking up single colony of pSB1A2(I732019,I732950) and pSB4A5(K193602).[Nakamura]
- DNA midiprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0420).[Nakamura]
- Increasing promoter by PCR and checking by agarose gel electrophoresis.[Takeuchi]
- Preparing chemically competent cells.[Furumichi]
- (1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のシングルコロニーを得る
- (3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
- (4) プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
- (5) 18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う
Method
- (1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
- -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
- ↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
- ↓on ice 30min
- ↓45℃で45sec、ヒートショック
- ↓on ice 2min
- ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
- ↓37℃で1h、振とう培養
- ↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight
- (2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク
- pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした
- ↓37℃でインキュベート
- (3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
- E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
- ↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
- ↓遠心後、上清を捨てた
- ↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した
- ↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した
- ↓この吸光度を計測した
- (4) PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
- PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
<組成> PrimerF 各1.5μL PrimerR 各1.5μL テンプレートDNA
(DH5α、JM109)1μL Buffer for KOD-Plus 5μL 2mM dNTPs 5μL 2mM MgSO4 2μL KOD-Plus(1U/μL) 1μL MilliQ 33μL <設定> Pre Denature 94℃ 2min Denature 94℃ 15sec Annealing 62.8℃ 30sec Extension 68℃ 20sec 4℃ ∞
- PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
- DNA量 5μL
- Loading Buffer 1μL
- の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した
- (5) コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
- 前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、
- 0.9と理想の数値O.D=0.4~0.8からはずれていたので、
- 全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した
- ↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、
- 全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた
- ↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った
- ↓遠心管に移して氷上10分間放置した
- ↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した
- ↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した
- ↓1.5mlのDMSO(7%)を加え氷上で10分間放置した
- ↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ
- ↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った
- ↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、
- 作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた
- ↓15分間氷上に放置した
- ↓42℃で40秒間熱ショックを与えた
- ↓10分間氷上に放置した
- ↓4℃で保存した
- ↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた
- ↓37℃で一晩インキュベートした
Result
- (1) 十分な数のコロニーを確認できた
- (2) シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた
- (3) 濁度を測定した結果を以下の表にまとめた
pSB1A2 pSB1C3 1回目 0.104 0.051 2回目 0.103 0.033 3回目 0.120 0.046 4回目 0.115 0.052 5回目 0.122 0.030 平均 0.113 0.0424 これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
- (4) PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった
- これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる
- 後日、Extensionが不十分であったことも判明した
- (5) 形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した
- 20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する